Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ "К-58" ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств для специфической профилактики и диагностики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц.

ИББ птиц - (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) широко распространенная высококонтагиозная вирусная болезнь цыплят, преимущественно в возрасте 15-80-суток, характеризующаяся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями и диареей.

ИББ протекает остро, с характерной клиникой заболевания, и субклинически. Широкое распространение имеет субклиническая форма. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патолого-анатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднение при постановке диагноза. Поэтому проведение лабораторных исследований имеет решающее значение при постановке диагноза и требует наличия специфических высокоактивных стандартных антигенов и сывороток.

Штаммы вируса ИББ птиц, используемые для производства антигена и иммунной сыворотки, должны быть достаточно вирулентными, свободными от контаминации и обладать высокой биологической и антигенной активностью. Технология производства антигена при ИББ предусматривает инактивацию вируса, поэтому штаммы должны быть чувствительными к воздействию общепризнанных инактивирующих препаратов и контролироваться на полноту инактивации.

ИББ птиц зарегистрирована во всех странах мира. В последние годы ИББ получила широкое распространение в большинстве крупных птицеводческих хозяйств России.

Экономический ущерб от ИББ, обусловленный гибелью цыплят до 20-70% при остром течении заболевания, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, а также в результате возникновения вторичных инфекций, очень велик.

В настоящее время общепризнанно, что единственно правильными и надежными направлениями в борьбе с данной инфекцией являются своевременная диагностика заболевания и его вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики ИББ используют живые и инактивированные вакцины.

Известной особенностью возбудителя ИББ является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки и на разных территориях и зависящая от видового и породного состава птичьего поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов.

В связи с этим выбор вакцинного штамма вируса ИББ птиц проводится с учетом антигенной структуры эпизоотического изолята, а для приготовления вакцинных препаратов используют производственные штаммы, обладающие наибольшей степенью гомологии в области антигенной детерминанты с эпизоотическими изолятами вируса ИББ (1).

В зарубежной практике известен ряд штаммов вируса ИББ птиц, используемых для изготовления диагностических препаратов к данной инфекции: штамм "SR-1" (4) и штамм "1/PY". Указанные штаммы репродуцируются на SPF-цыплятах (свободных от патогенных факторов) или в культуре клеток различного происхождения (2).

Однако размножение вируса в культуре клеток вызывает снижение его антигенной активности. Образцы антигена и сыворотки, полученные из данных штаммов, обладают низкой антигенной активностью и не поддаются стандартизации.

Кроме того, вышеуказанные штаммы непригодны для использования в качестве вакцинных.

Известно использование высокоактивных вирулентных штаммов вируса ИББ птиц для изготовления диагностикумов.

Известен штамм "cheville", используемый для производства антигенов и сывороток для лабораторной диагностики ИББ птиц (2). Однако указанный штамм не пригоден для изготовления вакцин.

Известен также штамм ГКВ №2105 вируса ИББ птиц для получения диагностикумов. Штамм репродуцируют и титруют на коммерческих цыплятах 35-40-суточного возраста и куриных эмбрионах. Штамм вызывает характерную клиническую и патологоанатомическую картину заболевания через 48-72 часа с титром вируса 5,5-6,0 lg ЭИД₅₀/см³, активность сыворотки крови достигает в реакции нейтрализации (pH) 1:1024 и в реакции диффузионной преципитации (РДП) 1:64. Вирус свободен от контаминации, специфичен и активен (2).

Недостатком данного штамма является его вирулентность, что всегда создает проблемы при соблюдении требований ветеринарно-санитарного режима.

В большинстве случаев вакцинные штаммы непригодны для изготовления диагностикумов по причине их низкой антигенной активности.

Известен штамм "Винтерфилд-2512" вируса ИББ птиц, репродуцируемый на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур и используемый для приготовления вакцинных препаратов (3, 4, 5).

Известен штамм BIA 52/70 вируса ИББ для приготовления вакцинных препаратов, репродуцируемый в ткани фабрициевых сумок цыплят 30-40-дневного возраста или на аллантоисных мембранах куриных эмбрионов (6, 7, 8).

Известен штамм Д-78 (АТСС №VR-2041) вируса ИББ птиц, репродуцируемый на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур и используемый для приготовления вакцинных препаратов (9).

Известен штамм GP/82 (NCAJM №V(Р)-001033) вируса ИББ птиц, репродуцируемый в культуре клеток фибробластов эмбрионов SPF-кур и используемый для приготовления вакцинных препаратов (10).

Известен штамм "ВНИВИП" вируса ИББ птиц, используемый для изготовления вакцинных препаратов (11).

Известен штамм "КБК" вируса ИББ птиц, репродуцируемый в перевиваемой культуре клеток почки серо-зеленой мартышки ВГ М-70 и используемый для приготовления вакцинных препаратов (12).

Известен штамм "Винтерфилд 84" - ДЕП" вируса ИББ птиц, репродуцируемый в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур или на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур и используемый для изготовления вакцинных препаратов (13).

Известен штамм "Био-92 №115 - ДЕП" вируса ИББ птиц, репродуцируемый в культуре клеток эмбрионов кур или в культуре клеток эмбрионов перепелов и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Общими недостатками известных штаммов являются их низкая антигенная и иммуногенная активность.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм "БГ" №102 - ДЕП" вируса ИББ птиц, репродуцируемый на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (15).

По своей антигенной и иммуногенной активности штамм "БГ" №102 - ДЕП" превосходит все известные штаммы вируса ИББ птиц, из которых готовили вакцинные препараты, применяемые на территории Российской Федерации и стран СНГ(16).

Однако штамм-прототип имеет недостаток, состоящий в том, что он незначительно индуцирует редукцию бурсы.

Таким образом, проблема поиска, отбора и изучения эпизоотических изолятов возбудителя ИББ для получения новых производственных штаммов вируса ИББ птиц, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью как в нативном виде, так и после инактивации и пригодных для изготовления высокоспецифических и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных вакцинных препаратов, остается актуальной.

В задачу создания настоящего изобретения входило получить новый производственный штамм вируса ИББ птиц, обладающий высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодный для изготовления средств диагностики и специфической профилактики ИББ птиц.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов вируса ИББ птиц, обладающих высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодных для изготовления высокоспецифических и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных живых и инактивированных вакцинных препаратов.

Указанный технический результат достигнут получением аттенуированного штамма "К-58" (авторское наименование) вируса ИББ птиц. Штамм является новым, ранее неизвестным.

Исходный вирус для получения штамма "К-58" выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров на птицефабрике "Васильевская" Пензенской области в 1994 году. Производственный штамм "К-58" получен путем многократных последовательных пассажей исходного изолята на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур и SPF-цыплятах.

Штамм "К-58" депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 1 июня 2004 года под регистрационным номером - штамм "К-58 №122 - ДЕП" вируса ИББ птиц.

По сравнению со штаммом-прототипом штамм "К-58 №122 - ДЕП" является безвредным и обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Штамм "К-58 №122 - ДЕП" вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "К-58 №122 - ДЕП" вируса ИББ птиц относится к семейству Birnaviridae, роду Avibirnavirus, серотипу I и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона икосаэдрическая, размер вириона 58-60 нм. Капсид Т13, оболочка отсутствует.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм "К-58 №122 - ДЕП" относится к сероварианту I. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых РДП в разведении 1:4-1:64, в ИФА-1:400-1:10000 и более, при гипериммунизации в РДП до 1:4096 и выше, в ИФА>1:10000. При определении антигенного соответствия вакцинного штамма "К-58 №122 - ДЕП" с полевыми изолятами вируса ИББ было проведено сравнение вариабельной области VP2 37 полевых изолятов, выделенных в 1993-1996 гг. на территории РФ и странах СНГ и 7 образцов коммерческих живых вакцин. Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Taq-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена VP2, кодирующую основной конформационный эпитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакцинного штамма ИББ. Установлено, что большинство полевых изолятов вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигенно отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм "Рон-Мерье" (Франция), "Интервет" (Голландия), "Солвей-Дюфар" (США), "Сафит" (Израиль) на 5-8% и имеют структуру, близкую к вакцинному штамму "К-58 №122 - ДЕП".

Биотехнологические характеристики

Штамм "К-58 №122 - ДЕП" предназначен для изготовления живой и инактивированной вакцин и диагностических биопрепаратов. Штамм "К-58 №122-ДЕП" репродуцируется в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур при температуре 37,7°С и влажности 55-64%. В течение 72-96 часов инкубирования вирус накапливается до 5,5-7,0 lg ЭИД_{50/0,2 см} ³.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм "К-58 №122 - ДЕП" является РНК-содержащим вирусом с мол.массой РНК 2,16×10⁶ Da. Нуклеиновая кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (А и В). Вирус имеет белковую оболочку, образованную 5 видами белков (VP1, VP2, VP3, VP4 и VP5):

VP1 - РНК-зависимая РНК-полимераза;

VP2, VP3 - структурные белки;

VP4 - протеаза;

VP5 - не идентифицирован.

Липиды отсутствуют.

Штамм "К-58 №122 - ДЕП" проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в области РНК, кодирующей VP2. Мутации, ведущие к замене аминокислот, определяют антигенную вариабельность VP2.

Штамм "К-58 №122 - ДЕП" проявляет высокую степень гомологии (98%) по сравнению с многочисленной группой изолятов (30), выделенных на территории РФ в 1993-1996 г.г.

Физические свойства

Масса вириона составляет - 55,0×10⁶ Da. Коэффициент седиментации 460S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33-1,34 г/см³ в градиенте CsCl.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "К-58 №122-ДЕП" устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению и высыханию.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - 100%;

Реактогенность - отсутствует;

Патогенность - отсутствует;

Вирулентность - отсутствует;

Онкогенность - отсутствует;

Контагиозность - отсутствует.

Штамм "К-58 №122 - ДЕП" является стабильным и безвредным.

Стабильность аттенуации отмечена при проведении 5 пассажей на чувствительных цыплятах.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования.

Пример 1

Матровую расплодку вируса из штамма "К-58 №122 - ДЕП" на эмбрионах SPF-кур получают следующим образом. На границе подскорлупной оболочки и хориоаллантоисной оболочки (ХАО) делают насечку, не повреждая ХАО, и затем с помощью шприца вводят вируссодержащий материал в количестве 0,2 см³ на ХАО. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем. Инфицированные эмбрионы инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С. Вируссодержащий материал размораживают, измельчают, экстрагируют при температуре 4°С в течение 45 минут, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5, центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин. Полученную вируссодержащую жидкость используют в качестве матровой расплодки.

Пример 2

Приготовление диагностического антигена

SPF-цыплятам 14-21-суточного возраста инокулируют вирус штамма "К-58 №122 - ДЕП" (интраокулярно, интраназально или орально). Через 72 часа цыплят убивают, берут бурсы, замораживают. Затем бурсы мелко размельчают, растирают со стерильным стеклянным песком, смешивают с фосфатным буфером 1:1, дважды промораживают, центрифугируют 1 мин при 3000 об/мин, супернатант сливают, инактивируют и используют для работы.

Результаты исследований в РДП активности антигена, приготовленного из штамма "К-58 №122 - ДЕП", представлены в таблице 1.

Пример 3

Приготовление диагностической сыворотки

SPF - цыплятам 14-21-суточного возраста инокулируют орально живую вакцину из штамма "К-58 №122 - ДЕП" вируса ИББ. Через 14 суток вводят внутримышечно инактивированный антиген с масляным адъювантом. Через две недели цыплят обескровливают и получают гипериммунную сыворотку, определяя ее активность в РДП и ИФА. Результаты исследований сыворотки представлены в таблицах 2 и 3.

Пример 4

Приготовление сухой диагностической сыворотки

SPF - цыплятам 14-21-суточного возраста вводят орально живую вакцину из штамма "К-58 №122 - ДЕП" вируса ИББ. Через 14 суток цыплятам инокулируют внутримышечно инактивированный антиген с масляным адъювантом, через 10 суток антигенный препарат вводят повторно, а через 7 суток цыплят обескровливают, получают сыворотку и определяют ее активность.

К исследованной сыворотке добавляют стабилизирующие добавки и ее подвергают лиофилизации. Лиофилизованную сыворотку используют для наборов ИФА и РДП. Результаты исследований полученной сыворотки представлены в таблице 4.

Пример 5

Приготовление и испытание инактивированной вакцины

Инактивированную вакцину против ИББ птиц из штамма "К-58 №122 - ДЕП" готовят из вируса, выращенного в развивающихся эмбрионах SPF-кур так, как описано в примере 1.

Вирус инактивируют аминоэтилэтиленимином, сорбируют на гидроокись алюминия с добавлением сапонина.

Результаты исследований по определению иммуногенной активности инактивированной вакцины из штамма "К-58 №122 - ДЕП" представлены в таблице 5.

Пример 6

Приготовление живой вакцины

На первом этапе готовят матровый материал из штамма "К-58 №122 - ДЕП" вируса ИББ птиц так, как описано в примере 1. Полученную вируссодержащую жидкость используют для массового заражения 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур. Вирусный материал в количестве 0,2 см³ вводят на ХАО и инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С и полученное сырье используют при изготовлении вакцины. Вируссодержащий материал размораживают, измельчают на коллоидной мельнице, экстрагируют в течение 45 минут при температуре 4°С, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5 и центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин. Вируссодержащую надосадочную жидкость осторожно сливают в стерильных условиях, а затем добавляют стабилизатор, в качестве которого можно использовать (отдельно или в комбинации) обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др., расфасовывают во флаконы, промораживают при температуре минус 60-80°С и подвергают лиофилизации. Лиофилизованный материал закупоривают под вакуумом и подвергают исследованию на иммуногенность (на 14-суточных SPF-цыплятах) и на безвредность (на 30-суточных SPF-цыплятах).

Полученная вакцина представляет собой сухую однородную массу розово-коричневого цвета в виде цилиндрической таблетки, растворимой в воде. При растворении в воде до исходного объема она превращается в стойкую однородную суспензию розово-коричневого цвета.

Вакцину применяют в хозяйствах, где регистрируют клинические и патологоанатомические признаки проявления ИББ. Цыплят вакцинируют с 10-14-суточного возраста с интервалом 10-14 суток в дозе 100-1000 ЭИД_50/см ³ методом выпаивания.

Иммунитет у птиц наступает через 14-21 сутки после второй прививки и сохраняется в течение всего восприимчивого к ИББ периода.

Полученная вакцина при титровании на 9-11-суточных SPF-цыплятах имеет титр 5,5-7,0 lg ЭИД_{50/0,2 см} ³.

Пример 7

Испытание сухой живой вакцины

Определение иммуногенной активности вакцины изготовленной так, как описано в примере 6, проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-кратные разведения вакцины и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания. Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 14 суток после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в таблице 6.

Данные таблицы 6 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 100% защиту цыплят, а выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой иммунизации птиц.

Пример 8

Сравнительная оценка вирусвакцин против ИББ птиц

В лабораторных экспериментах и в условиях птицехозяйств Российской Федерации проведена сравнительная оценка иммуногенной активности отечественных и импортных живых вакцин против ИББ и показано, что вирусвакцина сухая против ИББ из штамма "БГ" №102 - ДЕП" является более эффективным препаратом по сравнению с другими отечественными и импортными препаратами. Поэтому оценку иммуногенной активности штамма "К-58 №122 - ДЕП" провели в сравнении со штаммом "БГ" №102 - ДЕП".

Результаты сравнительной оценки иммуногенной активности штамма "БГ" №102 - ДЕП" и штамма "К-58 №122 - ДЕП" представлены в таблице 7.

Данные таблицы 7 свидетельствуют о том, что штамм "К58 №122 - ДЕП" является более надежным и эффективным, так как он в 1,5 раза выше индуцирует титр антител по сравнению со штаммом "БГ" №102 - ДЕП".

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм "К-58 №122 - ДЕП" вируса ИББ птиц, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает по сравнению со штаммом-прототипом более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и расширяет арсенал штаммов вируса ИББ птиц, пригодных для изготовления высокоспецифических и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных вакцинных препаратов.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Сюрин В.Н. и соавторы. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, 65-84.

2. Авт.свид. СССР №1761802, С 12 N 7/00, 22.11.90 г.

3. Winterfild R.W. Immunity response to the infectious bursal agent // Avian Dis., 1969, 13, 548-557.

4. Winterfild R.W. et al. Immune response and pathogenecity of different strains of infectious bursal disease virus applied as vaccines // Avian Dis., 1978, 22, 4, 721-731.

5. Winterfild R.W. et al. Characteristics of apparent derivates of the 2512 strain of infectious Bursal Disease virus when used as vaccines // Avian Dis., 1981, 25, 4, 900-910.

6. Wyeth P.F. The veterinary Record, 1979, 104, 188-193.

7. Lucia B et al. Avian Diseases., 1979, 23, 2, 466-478.

8. Пат. Румынии №100319, А 61 К 39/12, 29.10.90.

9. Пат. США №4530831; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00, 23.07.85.

10. Пат. Венгрии №203781; С 12 N 7/00, А 61 К 39/12; 28.08.90.

11. Авт. свид. СССР №1824443, С 12 N 7/00, 19.03.91.

12. Пат. РФ №2205021; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 27.05.99.

13. Пат. РФ №2127604; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 20.03 99.

14. Пат. РФ №2191825; С 12 N 7/00, А 61 К 39/12; 27.10.02.

15. Пат. РФ №2127602; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 20.03.99 (прототип).

16. Скутарь И.Г. и соавт. Профилактика инфекционных болезней птиц в условиях республики Молдова //Ветеринария, 1997, 2, 12-13.