Способ оценки функциональных резервов новорожденного организма

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарной неонатологии, которое может быть использовано в клинической практике для раннего и своевременного выявления осложненного течения неонатального периода, в частности к способу оценки функциональных резервов новорожденного организма на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов оценки функциональных резервов новорожденного организма.

Известен способ определения состояния новорожденного организма, заключающийся в том, что с целью выявления непроявляющихся клинических форм патологий у недоношенных новорожденных автор предлагает определять активность изоцитратдегидрогеназы в плаценте и по повышению активности фермента прогнозировать развитие осложнений (см. А.с. СССР №651790 М.Кл.² А61В 10/00 опубл. 15.03.1979).

Недостаток данного способа в том, что он применим только в случае преждевременных родов, что сужает диапозон его полезного использования. Кроме того, определение изоцитратдегидрогеназы в плаценте достаточно сложно технически и требует значительных временных затрат, специального оборудования и реактивов

Известен способ диагностики нарушения состояния новорожденного во время родов, заключающийся в том, что у роженицы при раскрытии на 13 см шейки матки и повторно при раскрытии на 6-10 см определяют в эритроцитах крови активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы / Г-6-ФД / и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы / 6-ФГД /, а в сыворотке крови активность изоцитратдегидрогеназы / ИЦД / и лактатдегидрогеназы / ЛДГ /, и по изменению отношений ИЦД / ЛДГ и Г-6-ФД / 6-ФГД диагностируют нарушение состояния новорожденного в перинатальном периоде (см. А. с.СССР №670300, М.Кл.² А61В 10/00, G 01N/33/16).

Этот способ имеет ряд недостатков: технически сложен, требует двухкратное определение двух ферментов сыворотки крови и двух в эритроцитах после их выделения, сложных математических расчетов; инвазивен, производится в венный забор крови у роженицы; необходимо динамическое / 2-х кратное / наблюдение; требуется проведение неоднократного влагалищного исследования у роженицы, что сопряжено с риском развития послеродовых инфекционных осложнений.

Известен способ определения тяжести асфиксии новорожденного, характеризующийся тем, что в 1-ые сутки жизни из пробы крови готовится суспензия эритроцитов с измерением гематокрита с последующим определением способности к деформации эритроцитов и по величине этого показателя делают вывод о степени тяжести (см. А.с. СССР №1448278, М. Кл. G01N 33/48).

Приведенный метод имеет ряд недостатков: он не направлен на прогнозирование осложнений в перинатальном периоде, а свидетельствует только о тяжести асфиксии; необходим забор крови новорожденного в 1-ые сутки жизни; для приготовления суспензии отмытых эритроцитов необходимо достаточно большое количество крови и временные затраты.

Известен способ прогнозирования состояния здоровья новорожденных телят, заключающийся в том, что в крови сухостойных коров определяют содержание метгемоглобина и при его уровне более 12,5% констатируют неблагоприятный прогноз в отношении заболеваемости желудочно-кишечными болезнями (см. патент Р.Ф. №2057485, МПК C1 А61В 10/00, А01K 67/02, опубл. 10.04.1996).

Недостатком данного способа является то, что увеличение содержания метгемоглобина в крови указывает на наличие отравления животных определенной группой токсинов, последствием которого является гипоксия плода с соответствующими изменениями клинико-функционального статуса новорожденных. Практическую значимость данный способ имеет только в случаях отравления беременных коров, что на практике встречается сравнительно редко.

Предложена дифференциальная таблица, в которой на основании параметров массы тела, высоты в холке, охвата за лопаткими и др. промеров оценивают степень зрелости новорожденного (Методические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению омфалита у новорожденных телят / Золотарев А.И., Тумилович Г.А. и др.. / Сб. науч. тр. Гродн. гос. аграр. Ун-т. 2008).

Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель массы тела претерпевает существенные изменения в течение первых часов жизни, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, отхождением мекония, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей, время облизывания теленка, количество выпаиваемого молозива и т.п.). Масса тела приплода также зависит от породы. Однако в условиях сравнительно широкого спектра вариантов скрещивания, используемых в хозяйствах, породные особенности массы тела менее выражены, что может дать ошибочную информацию о степени развития новорожденного. Высокая вариабельность разводимого скота также снижает информативность таких параметров как высота в холке, охват за лопатками, длина хвоста, длина последнего ребра и других промеров и зависит от породных особенностей матери. Последние определяются породой или вариантами скрещивания.

Известен способ оценки уровня естественной резистентности организма животных в ранний постнатальный период, заключающийся в том, что в сыворотке крови определяют общий белок и, при содержании его менее 50 г/л, констатируют низкий уровень резистентности организма (см. патент Р.Ф. №2260185, МПК C1, G01N 33/48, опубл. 10.09.2005)

Однако данный способ имеет сравнительно низкую информативность в отношении уровня антенатального развития, так как содержание белка в крови новорожденных в основном определяется качеством и временем выпаивания молозива.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ определения жизнеспособности новорожденных животных, заключающийся в том, что в крови до приема молозива определяют специфические антитела. Их обнаружение расценивается как физиологическое недоразвитие (см. патент Р.Ф. №2050130, МПК C1 А01K 67/02, G 01N 33/53, опубл. 20.12.1995).

Однако недостатком данного способа является отсутствие информации о происхождении антител. Так, причиной данного явления может быть нарушение плацентарного барьера, что не является основанием для констатации нарушения развития плода. Помимо этого, у здоровых новорожденных может содержаться в крови небольшое количество антител, что является следствием особенности развития их иммунокомпетентных органов.

Недостатком большинства способов оценки физиологического развития новорожденного является их акцентирование на антенатальное развитие. Однако статус новорожденного, помимо этого, определяется и интранатальным периодом. Нарушения в период рождения являются не менее актуальными в формировании морфофункционального статуса новорожденного, чем проблемы внутриутробного развития.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа оценки функциональных резервов новорожденного организма, направленного на более релевантную оценку функциональных резервов новорожденных животных, путем биологического теста по реакции лейкоцитолиза крови материнского организма в присутствии сыворотки крови новорожденного животного, обладающего ускорением, упрощением и повышением точности прогнозирования развития новорожденного организма.

Технический результат достигается путем оценки функциональных резервов новорожденного организма, включающий исследование крови с проведением биологического теста, в качестве которого используют реакцию лейкоцитолиза крови материнского организма с присутствием сыворотки крови новорожденного животного. Все это сводится к определению жизнеспособности новорожденного животного путем осуществления контрастных реакций лейкоцитолиза крови в биологической системе «мать-новорожденный».

Данный технический результат осуществляется за счет выявления состояния повышенной чувствительности материнского организма к антигенам плода реакцией лейкоцитолиза клеток в присутствии специфических белков новорожденного организма. Белки сыворотки крови изоиммунизированных новорожденных, вызывают специфические повреждения сенсибилизированных лейкоцитов крови материнского организма и не действуют на лейкоциты, которые по отношению к ним не проявляют повышенной чувствительности. Благодаря этому представляется возможным по установленной формуле вычислить процент лизированных лейкоцитов материнского животного под воздействием сыворотки крови новорожденного животного. После чего провести оценку выполненной реакции и установить прогноз функциональных резервов новорожденного организма.

В настоящее время все большее внимание уделяют разработке биохимических способов диагностики, основанных на многозвеньевых межсистемных процессах, отражающих патогенетические, компенсаторные, адаптивные сдвиги, сопутствующие осложненному его течению. Но, несмотря на разнообразие методов, их не всегда можно использовать в диагностическом процессе из-за сложности, а иногда из-за низкой информативности; кроме того, многие из них не обладают необходимой специфичностью. Поэтому проблема создания достаточно простого, доступного для широкого круга лечебных учреждений, и в то же время надежного способа прогнозирования развития новорожденного остается актуальной.

Краткое описание чертежей и иных материалов

В таблице 1 приведены показатели аллергической альтерации лейкоцитов овцематок опытной и контрольной групп.

В таблице 2 приведены показатели естественной резистентности опытной группы и контрольных групп ягнят.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа оценки функциональных резервов новорожденного организма.

Пример 1.

В две пробирки вносят по 0,3 мл слабо подкрашенного метиленовой синькой раствора ацидин-пепсина в концентрации 25 мг/мл. В первую (опытную) добавляют 0,1 мл сыворотки крови новорожденного, а во вторую (контрольную) - 0,1 мл стерильного физиологического раствора. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,02 мл крови материнского животного организма. Пробы тщательно перемешивают и помещают в термостат на 2 часа при температуре 37,5°С.

Кислая среда раствора ацидин-пепсина создает условия для осмотического разрушения эритроцитов исследуемой крови, лейкоциты при этом остаются не разрушенными.

Белки сыворотки крови новорожденных, содержащиеся в опытной пробе, вызывают специфические повреждения сенсибилизированных лейкоцитов крови материнского организма и не действуют на лейкоциты, которые по отношению к ним не проявляют повышенной чувствительности. Выявить повреждения лейкоцитов путем подсчета возможно лишь в том случае, если они будут полностью разрушены. Разрушение поврежденных лейкоцитов осуществляется ферментом пепсином, который в кислой среде действует только на поврежденные клетки и не действует на неповрежденные. Такое избирательное действие пепсина на поврежденные лейкоциты обеспечивает разницу при их подсчете.

После инкубирования содержимым обеих пробирок поочередно заполняют камеру Горяева и подсчитывают количество лейкоцитов в 25 больших квадратах по общепринятой тривиальной методике, принятой для подсчета лейкоцитов.

Для вычисления процента лизированных лейкоцитов материнского животного под воздействием сыворотки крови новорожденного животного используют формулу:

где, ПАА - показатель аллергической альтерации лейкоцитов;

Л - количество лейкоцитов.

Пример 2.

По примеру 1. d первые дни после окота у овцематок и соответственно у их потомства (ягнят) были взяты пробы крови и определены показатели аллергической альтерации лейкоцитов. Результаты изложены в таблице 1.

Итак, всего было исследовано 70 овцематок и у 22 из них установлена повышенная чувствительность к белкам сыворотки новорожденных, т.е. показатель аллергической альтерации лейкоцитов составил 10% и выше.

Ягнята, рожденные от овцематок с повышенной чувствительностью к фетальным антигенам (показатель аллергической альтерации лейкоцитов 10% и более) были менее жизнеспособными, что подтверждает пример 3.

Пример 3.

Предлагаемый способ изучался на двух группах новорожденных ягнят. В опытную группу вошли ягнята, у маток которых наблюдалась повышенная чувствительность к антигенам новорожденных (см. пример 2). Контрольная группа представлена ягнятами от несенсибилизированных овцематок. Различия между овцематками по показателям аллергической альтерации лейкоцитов были статистически достоверными. Этот показатель в группе овцематок с повышенной чувствительностью составил 26.90±0,59%, а в контрольной группе - 6,49±0,39%.

У ягнят обеих групп в суточном возрасте исследовали кровь по показателям естественной резистентности. В течении 7 месяцев учитывалась заболеваемость и летальность животных. Результаты исследований приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, опытная и контрольная группы ягнят существенно отличались друг от друга по показателям, характеризующим состояние естественной резистентности. При анализе гематологических показателей установлено, что ягнята, родившиеся от сенсибилизированных овцематок, имеют меньшее количество эритроцитов в 1 мм³ крови (10.41±0,56) по сравнению с ягнятами контрольной группы (13,63±0,28). Идентичные различия наблюдаются между группами животных по содержанию гемоглобина, скорости оседания эритроцитов (СОЭ). По содержанию лейкоцитов в 1 мм³ крови существенных различий между группами животных не установлено. Однако функциональная активность лейкоцитов у животных опытной группы было значительно ниже, чем у контрольной.

Фагоцитарная активность нейтрофилов у ягнят контрольной группы составила в суточном возрасте 85,76±1,81%, а у ягнят опытной группы она была соответственно 68,72±3,02%. Имели место различия и по другим показателям лейкоцитарного фагоцитоза (ФИ, ФЧ).

Лизоцимная активность сыворотки крови также имелись достоверные различия, причем эти показатели у контрольной группы значительно превосходили опытную.

Потомство (ягнята) опытной и контрольной групп отличались между собой по живой массе. Так масса тела у животных опытной группы составила 3.796±0,12 кг, а у животных контрольной - 4.596±0,19 со статистически достоверным различием соответственно.

Таким образом, по показателям естественной резистентности в суточном возрасте ягнята, рожденные от маток с повышенной чувствительностью к белкам сыворотки крови, существенно отличались от своих сверстников. Слабое проявление естественной резистентности и более низкая масса ягнят у опытной группы связана с нарушением планцентарного барьера, явлениями изоиммунизации материнского организма антигенами плода и неблагоприятным влиянием иммунологических факторов материнского организма на процессы роста и развития плода.

Доказательством того, что изоиммунизация в период беременности имела место, может служить увеличение скорости оседания эритроцитов и снижения их количества у ягнят опытной группы по отношению к контрольной. Известно, что изоиммунные антитела, а такие сенсибилизированные лейкоциты, попадая в организм плода через плаценту или с молозивом, вступают в иммунологическую реакцию с эритроцитами новорожденного, которые содержат антитела. Это приводит к изменению коллоидных свойств оболочек эритроцитов, в результате чего они легко агглютинируют и подвергаются разрушению.

Важным критерием жизнеспособности новорожденных животных является заболеваемость и летальность в процессе онтогенеза. В результате проведенных испытаний было установлено, что в месячном возрасте заболеваемость в опытной группе составила 16,0%, а в контрольной 4,0%. Летальность в опытной группе составила 12,0%. В контрольной группе случаев падежа не регистрировалось. Дальнейшие наблюдения за ягнятами до 7 месячного возраста показали, что процент заболеваемости и летальности в опытной группе значительно выше, чем в контрольной. Всего пало в опытной группе 24,0%, а в контрольной 4,0%.

Плод практически во всех случаях беременности в антигенном отношении является чужеродным для материнского организма, так как часть генетического материала он получает от отцовского организма.

Взаимозащита матери и плода от воздействия иммунологических факторов связана с наличием биологических барьеров - плаценты, плодных оболочек и околоплодной жидкости. Наличие плацентарного барьера исключает возможность иммунизации (изоиммунизации) организма матери антигенами плода и наоборот, попадание иммунологических факторов материнского организма в организм плода.

Учитывая высокую интенсивность процессов роста и развития, а также тот факт, что питание плода осуществляется через плаценту, важное значение имеет внутриутробное развитие и полноценность плацентарного барьера.

Барьерная функция плаценты проявляется только в физиологических условиях. Под воздействием патогенных факторов барьерная функция плаценты нарушается и она становится проницаемой даже для таких веществ, которые в обычных физиологических условиях через нее проходят в ограниченном количестве.

При нарушении плацентации (плацентарного барьера) возникает состояние иммунного конфликта, характеризующегося реакцией антиген-антитело и осуществляющегося через плаценту (по отношению к плоду), либо через молозиво после рождения (по отношению к новорожденному организму).

Нарушение плацентарного барьера сказывается на процесса роста и развития плода с одной стороны, а с другой - происходит изоиммунизация материнского организма антигенами плода, сопровождающаяся повышением чувствительности организма с преобладающим проявлением клеточных феноменов, при отсутствии усиленного синтеза антител.

Состояние повышенной чувствительности материнского организма к антигенам плода устанавливается в реакции лейкоцитолиза клеток в присутствии специфических белков новорожденного организма.

Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами:

1. Предлагаемый способ предназначен для оценки иммунобиологического статуса новорожденного животного.

2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

3. Исключается необходимость инвазивных и стрессовых манипуляций у новорожденных животных в ранних периодах постнатального развития, которыми повышается их чувствительность, с возможными осложнениями.