Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Penicillium chrysogenum, обладающий нефтеокисляющей и лигно-целлюлозолитической активностью

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма мицелиальных грибов рода Penicillium вида Penicillium chrysogenum, который обладает нефтеокисляющей и лигно-целлюлозолитической активностью.

Из уровня техники известен способ осахаривания лигноцеллюлозного сырья, включающий подготовку сырья и обработку подготовленного сырья ферментным препаратом, в качестве которого используют культуральную жидкость, полученную культивированием штамма Penicillium verruculosum BKMF-3972D [RU 2405838 C1, 2010].

Известен [RU 2487933 C1, 2013] штамм Penicillium sp. ПБТ-2, обладающий полифункциональными свойствами и осуществляющий трансформации органических остатков природного происхождения и способствующий повышению продуктивности агроэкосистемы, депонированный в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ).

Известен штамм гриба Penicillium chrysogenum - продуцент бензил-пенициллина и феноксиметилпенициллина, [RU 2035514 С1, 1995; RU 1594991 С, 1995; RU 1549075 А1, 1994].

Известен штамм микромицета Penicillium sizovae P11 - деструктор лигнина древесины, хранящийся в коллекции бактерий Вятского государственного университета под регистрационным номером VGUCM-P11 [RU 2355753 С2, 2009].

Известен штамм гриба Penicillium chrysogenum BKMF-3330Д, используемый для получения биомассы, извлекающей радионуклиды и тяжелые металлы из жидкостей, [RU 2024078 С1, 1994].

Известен штамм гриба Penicillium species ЦКМ Fн 37Б, используемый для очистки поверхности воды от плавающей нефти [RU 2063435 С1, 1996].

В известных штаммах мицелиальных грибов рода Penicillium вида Penicillium chrysogenum штамма с нефтеокисляющей и лигно-целлюлозолитической активностью не обнаружено.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение нового штамма мицелиальных грибов Penicillium chrysogenum НД-1, обладающего нефтеокисляющей и лигно-целлюлозолитической активностью и обеспечивающего разрушение и биодеструкцию лигно-целлюлозосодержащих материалов, нефти и нефтепродуктов, а также делигнификацию загрязненных водных сред.

Технический результат достигается тем, что выявлен новый штамм Penicillium chrysogenum НД-1, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика; автор и депозитор Шарапова И.Э.) с регистрационным номером ВКПМ F-1373, обладающий нефтеокисляющей и лигно-целлюлозолитической активностью.

Штамм Penicillium chrysogenum НД-1 выделен в 2008 г. из почвы шламонакопителя нефтепродуктов (г. Сыктывкар Республики Коми) путем высева методом предельных разведений. Выделенную культуру изучали с целью установления ее литической способности к процессам биодеградации-разрушению лигно-целлюлозосодержащих материалов и нефтеуглеводородов. Штамм проявил значительную лигно-целлюлозолктическую и нефтеокисляющую активность, а также способность к биоделигнификации, биодеградации-разрушению лигноцеллюлозы и нефти.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Культурально-морфологические особенности Penicillium chrysogenum НД-1 (регистрационый номер ВКПМ F-1373): умеренно растущий штамм. Аэроб. На среде Чапека появляется через двое суток, колонии белого цвета, на 3-5-е сутки в средине серо-зеленого цвета, на 7-и сутки колонии темнеют до серого, с белым переходящим в оранжевый ободком, появляется пигмент розово-оранжевого цвета. На средах Сабуро (№2 ГРМ), МПА, пептонно-глюкозном агаре (№1 ГРМ) колонии белого цвета, с возрастом сероватого оттенка, без розового ободка.

Край колоний неровный, реснитчатый; диаметр колонии на 3-4 сутки 1-1,5 см. Колонии белого цвета, в средине серого цвета (серо-зеленого оттенка), зрелые колонии темнеют до серого с оранжевым ободком; субстратный мицелий желтоватого цвета; пигмент розово-оранжевого цвета, эксудат не образует; зрелые колонии темнеют до темно серого цвета с оранжевым ободком, который затем становится темно-серого или бурого цвета.

Микроморфологические признаки: середина колонии бледно-серого цвета, вегетативный мицелий, в краевой зоне активное спороношение; конидиеносцы гладкие неразветвленные одномутовчатые; моновертициллиата (фиалиды 4-6 шт.); споры гладкие продолговатые (цилиндрические), мелко шероховатые в длинных цепочках образующих колонку; склероции не образует.

Физиолого-биохимическая характеристика Penicillium chrysogenum НД-1 (регистрационый номер ВКПМ F-1373): штамм использует глюкозу, сахарозу, лактозу, глицерин, разжижает желатину, пептонизирует молоко, крахмал слабо гидролизует. На среде Эшби слабый рост. Хорошо растет на МПА, глюкозо-пептонном и пептонно-глицериновом агаре, на картофельно-глюкозном агаре, среде Чапека и Сабуро, на сусло-агаре, жидкой и агаризованной среде Гетчинсона с целлюлозой (фильтровальной бумагой). Солеустойчив.

Описание условий, необходимых для культивирования: среда следующего состава: на 1000 мл воды - сахароза 20 г, NaNO₃ - 3,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; Алканы - 3-5 г, 15-25°C, 4-7 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 3 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном сусло-агаре, агаре Чапека, КГА в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°C.

Видовое название Penicillium chrysogenum. Наименование микроорганизма, опознавательная ссылка, присвоенная депозитором - Penicillium chrysogenum НД-1.

Культура исследована по многочисленным свойствам, используемым в современной систематике. Анализ сходства нуклеотидной последовательности гена, кодирующего 18S рДНК, изучаемого штамма был проведен с помощью сервера BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast].

Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующей систематической группе: Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Pezizomycotina; Eurotiomycetes; Eurotiomycetidae; Eurotiales; Aspergillaceae; Penicillium.

Для установления филогенетического родства близких видов был также использован метод сравнения нуклеотидных последовательностей, кодирующих ген 5,8 S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 [Биохимия, 2007, 72, 12, 1659-1667].

Для установления филогенетического родства близких видов был также использован метод сравнения нуклеотидных последовательностей, кодирующих домен D1/D2 гена 26S р РНК. При секвенировании участка ДНК, кодирующего домен D1/D2 гена 26S рРНК, получена следующая последовательность:

Биотехнологические характеристики штамма Penicillium chrysogenum НД-1 (регистрационый номер ВКПМ F-1373) показаны на примерах.

Пример 1. Лигно-целлюлозолитическая активность. Увлажненные до 60% древесные опилки с фракционным составом 0,1-0,8 см обрабатывали 4-суточной культуральной суспензией штамма Penicillium chrysogenum с содержанием КОЕ/мл 10⁷ при соотношении 1 г : 10 г древесной массы. Изменение содержания целлюлозы (Кюршнера, азотно-спиртовой метод) и лигнина (Комарова, сернокислый метод) за 20 суток представлено в таблице 1.

Пример 2. Биоделигнификация. Водную среду, содержащую в составе лигносульфонаты, обрабатывали внесением 1 мл культуральной суспензии с титром КОЕ/мл 10⁷. До и после обработки в течение 10 суток в образцах среды с лигниновым компонентом снимали УФ-спектры с помощью спектрофотометра [Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии // Л.: Химия, 1986. 305 с.]. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Пример 3. Нефтеокисляющая активность и биосорбционная способность. Стерильную водопроводную воду с 0,5%-ым содержанием азофоски загрязняли нефтью 1% от объема воды. Нефтезагрязненную водную среду обрабатывали 1 мл культуральной суспензии с содержанием КОЕ/мл 10⁷ и выдерживали в лабораторных условиях 30 суток. Содержание нефти анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат-02» в соответствии с ПНД Ф 16.1.21-98. Результаты приведены в таблице 3.

Таким образом, штамм мицелиальных грибов Penicillium chrysogenum НД-1 (регистрационый номер ВКПМ F-1373) обладает нефтеокисляющей и лигно-целлюлозолитической активностью. Как видно из представленных в таблицах результатов штамм проявил значительную активность и способность к биодеградации-разрушению углеводородов нефти и лигноцеллюлозы и может быть использован для очистки от нефти и нефтепродуктов и для делигнификации загрязненных водных сред, а также для биодеградации лигно-целлюлозосодержащих материалов.