РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЗРЕЛОЙ СТАФИЛОКИНАЗЫ Staphylococcus aureus С ЛИДЕРНЫМ ПЕПТИДОМ ИЗ ШЕСТИ ГИСТИДИНОВЫХ ОСТАТКОВ, ШТАММ Escherichia coli MZ08 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА ЗРЕЛОЙ СТАФИЛОКИНАЗЫ С ЛИДЕРНЫМ ПЕПТИДОМ ИЗ ШЕСТИ ГИСТИДИНОВЫХ ОСТАТКОВ

Изобретение относится к области микробиологической фармацевтической промышленности.

Стафилокиназа (Sak) - белок, секретируемый некоторыми штаммами Staphylococcus aureus, состоящий из 136 аминокислотных остатков. Клинический интерес к этому бактериальному белку вызван благодаря его способности превращать плазминоген (неактивный профермент системы фибринолиза) в плазмин. Sak представляет собой эффективный и специфический тромболитический агент.

Рекомбинантные стафилокиназы разрабатываются несколькими фирмами мира, однако они отличаются друг от друга структурой генов (см., например, US 6010897, 01.04.2000, US 5801037, 01.09.1998, US 6902733, 07.06.2005, US 6383483, 05.07.2002, US 5951980, 14.09.1999, US 5695754, 09.12.1997, и др.).

Исследования рекомбинантной стафилокиназы показали, что некоторые структуры стафилокиназы склонны к образованию димеров и полимеров. Образование полимеров повышает иммуногенность стафилокиназы.

Предложены производные стафилокиназы, не склонные к образованию димеров и обладающие бифункциональностью тромболитического и антикоагулирующего агента. Эти производные отличаются от стафилокиназы дикого типа тем, что один или более аминокислотных остатков между аминокислотными остатками 104 и 113 стафилокиназы дикого типа замещены другими аминокислотами с образованием последовательности RGD или последовательности KGD. Разработан способ их получения (RU 2283863, 20.09.2006).

Недостатком указанного технического решения является невозможность применения лекарственного препарата на этой основе на этапе догоспитального тромболизиса в связи с увеличением опасности кровотечений. Это обусловлено тем, что последовательности RGD и KGD обладают дополнительным антикоагулянтным действием.

Наиболее близким к предложенному решению является изобретение по RU 2156299, 20.09.2000, в котором описана рекомбинантная ДНК, содержащая полную последовательность стафилокиназы и лидерный пептид с блоком из 6 гистидиновых остатков, штамм Е.coli SA 9325, являющийся продуцентом рекомбинантного белка, содержащего полную последовательность стафилокиназы из S.aureus.

Изобретение по RU 2156299 позволяет получить высокоактивный белок, обладающий фибринолитической активностью, с выходом рекомбинантного белка 20-26% от общего количества белков.

Однако известное решение обладает недостатком, так как вышеназванный штамм-продуцент кодирует белок, состоящий из 163 аминокислот (т.н. незрелая форма), который только в активной форме превращается в белок, состоящий из 136 аминокислот (т.н. зрелая форма).

В связи с этим задачей настоящего изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей последовательность стафилокиназы из 136 аминокислот и лидерного пептида, которые обладают повышенной активностью, а также создание нового эффективного штамма-продуцента на базе Е.coli и разработка процесса выделения и очистки целевого продукта с высоким выходом и чистотой.

Поставленная задача решается рекомбинантной плазмидной ДНК, которая содержит последовательность гена зрелой стафилокиназы Staphylococcus aureus с лидерным пептидом из шести гистидиновых остатков и имеет нуклеотидную последовательность, приведенную на фигуре 1.

Поставленная задача решается также штаммом Escherichia coli MZ08 - продуцентом рекомбинантного белка, содержащего последовательность гена зрелой стафилокиназы Staphylococcus aureus с лидерным пептидом из шести гистидиновых остатков, который имеет аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 1.

Поставленная задача решается также описываемым способом получения рекомбинантного белка, содержащего последовательность гена зрелой стафилокиназы с лидерным пептидом из шести гистидиновых остатков, характеризующимся аминокислотной последовательностью, приведенной на фигуре 1, который включает синтез рекомбинантной плазмидной ДНК, клонирование синтезированной последовательности с использованием вектора pQE30, трансформацию рекомбинантной плазмиды в клетки Escherichia coli M15Rep4, содержащие плазмиду с геном репрессора лактозного оперона, культивирование в условиях экспрессии ДНК, отбор клонов, обладающих оптимальной стафилокиназной активностью, выделение зрелой стафилокиназы с лидерным пептидом из шести гистидиновых остатков.

На фигуре 1 представлена нуклеотидная последовательность гена рекомбинантной стафилокиназы и соответствующая этому гену аминокислотная последовательность белка рекомбинантной стафилокиназы. На фигуре 2 представлена схема получения плазмиды с геном рекомбинантной стафилокиназы, состоящей из зрелого белка стафилокиназы и лидерного пептида с блоком из 6 гистидиновых остатков (а), и последовательность праймеров, использованных для аппликации фрагмента ДНК, содержащего ген зрелой стафилокиназы.

Подробное описание получения целевого продукта описано ниже и пояснено с помощью представленных фигур.

Для получения рекомбинантной ДНК был использован вектор pQE30. Синтезированы праймеры, комплементарные последовательности гена sac, кодирующей зрелый белок стафилокиназы, содержащие сайты рестрикции эндонуклеаз, необходимых для клонирования последовательности синтезированного ампликона в составе выбранного вектора pQE30. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с ДНК плазмиды, кодирующей полный ген sak из S.aureus с использованием полученных праймеров, синтезирован ампликон, несущий в своем составе ген зрелого белка Sak (фигура 2).

Клонирована синтезированная последовательность гена sak в составе векторной плазмиды pQE30. Затем ДНК рекомбинантной плазмиды была трансформирована в клетки E.coli M15Rep4, содержащие плазмиду с геном репрессора лактозного оперона, обеспечивающую индуцибельность синтеза клонированного белка. Из полученных трансформантов был отобран клон, обладающий оптимальной стафилокиназной активностью.

В результате был получен вариант гибридного белка, содержащий лидерную последовательность с блоком из 6 гистидиновых остатков и последовательность гена sak, кодирующего зрелый белок стафилокиназы (фигура 1).

Полимеразную цепную реакцию проводили в стандартном буфере; 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl, pH 9,0, 2,5 мМ MgCl₂.

ПЦР проводили с использованием в качестве матрицы гена sac ДНК плазмиды с полным геном sak из штамма S.aureus. В качестве отрицательного контроля использовааи хромосомную ДНК E.coli. Плазмидную ДНК выделяли, используя набор для выделения ДНК фирмы Promega в соответствии с прилагаемым протоколом.

Фрагмент ожидаемой длины обнаружен во всех пробах, кроме контрольной, содержавшей ДНК E.coli.

Далее в работе использовали все полученные ампликоны гена sak.

Клонирование sak-гена в мультикопийном векторе под сильным промотором бактериофага Т5

Рестрикцию и лигирование ДНК ампликонов и ДНК вектора проводили стандартными методами. Схема конструирования рекомбинатной плазмиды представлена на фигуре 2.

Полученными лигированными смесями, содержащими ДНК рекомбинантной плазмиды, трансформировали клетки штамма хозяина E.coli M15REP4. Используемая система предусматривает, что реципиентный штамм F-, lac-, mtl-, thi-, nal^s, str^s, rir, Km^R должен содержать плазмиду, несущую ген лактозного оперона laci и маркер устойчивости к канамицину (ген - кап). Продукт этого гена подавляет работу промотора, под контролем которого в составе мультикопийного вектора pQE30 будет находиться клонированный ген. Эффект репрессии обусловлен тем, что промоторная область pQE30 помимо промотора фага Т5 несет две lac-операторные последовательности, являющиеся объектом действия белка-репрессора Lacl. Действие репрессора в индуцибельных системах снимается работой индуктора, которым в данном случае может быть лактоза или ИПТГ.

Используемая система обеспечивает высокий уровень синтеза белков. Кроме того, нуклеотидная последовательность плазмиды pQE30 содержит дополнительные кодоны для синтеза в составе продуцируемой белковой молекулы шести дополнительных гистидинов (His). Вектор pQE30 содержит в своем составе маркер для селекции - ген bla, кодирующий устойчивость к ампициллину (Apr).

Получение штамма-продуцента

Трансформацию проводили следующим методом.

А) Приготовление компетентных клеток: клетки штамма хозяина M15[REP4] выращивали до ранней логарифмической фазы (OD=0,4) в 200 мл LB-бульона в качалочной колбе, затем осаждали центрифугированием при 3 тыс. оборотов (центрифуга К-23) в течение 10 минут при 4°С, ресуспендировали в 2/3 от исходного объема охлажденного 0,1 М CaCl₂ и инкубировали 40 минут во льду при 4°С, затем центрифугировали при 3 тыс. оборотов (центрифуга К-23) в течение 10 минут при 4°С. Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в 10 мл 0,1 М CaCl₂. К полученной суспензии добавляли 1,5 мл охлажденного глицерина, расфасовывали в эппендорфы по 100 мкл и хранили при -70°С.

По мере необходимости компетентную культуру использовали следующим образом. К 0,1 мл компетентных клеток M15Rep4 добавляли необходимое количество лигированной смеси или плазмид.

ДНК и смесь инкубировали на ледяной бане при 4°С 40 мин. Далее проинкубированную смесь подвергали термальному шоку на водяной бане 60 сек при температуре 42°С. Добавляли 0,25 мл среды LB и инкубировали при 37°С в течение часа, затем высевали на чашки с селективной средой: LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Через сутки инкубации выросшие АрКт (ампициллин-канамицин) резистентные клоны были однократно расчищены на селективной среде и подвергнуты дальнейшему анализу.

Б) Анализ трансформантов.

Полученные трансформанты наращивали в 5 мл среды LB содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл канамицина до оптической плотности 0,4 и добавляли ИПТГ. После 3-4 часов дополнительного инкубирования полученную культуральную жидкость центрифугировали, полученный осадок ресуспендировали в 100 мкл Н₂O и разрушали ультразвуком. Полученный лизат наносили на питательный агар, содержащий 30% плазмы крови человека (плазму перед добавлением в агар выдерживали 20 минут при 56°С). После 4 часов инкубации было установлено, что часть лизатов исследуемых клонов образовывали вокруг капельного рассева зоны лизиса. Этот положительный сигнал свидетельствовал о том, что трансформанты унаследовали интактную копию гена sak, кодирующую активную форму стафилокиназы (белка активатора плазминогена).

По результатам анализа для дальнейшей работы были отобраны 2 клона, которые показали максимальную зону лизиса.

В) Электрофоретический контроль содержания белка стафилокиназы

150 мкл культуральной жидкости кипятили на водяной бане 5 минут с последующим центрифугированием 5 минут при 15000 об/мин на центрифуге Eppendorf. 5 мкл супернатанта наносили в присутствии белкового красителя на 12% акриламидный гель. В качестве контроля молекулярного веса был использован маркер молекулярного веса белка фирмы "Fermentas". Было установлено, что количество определяемого белка составляет 15-20% от общего количества белков в клетках.

Г) Ферментация

Ферментацию рекомбинантного штамма проводят в 10-литровом ферментере.

Состав питательной среды (в г/л): тритон - 15,0; дрожжевой экстракт - 8,0; калий фосфорнокислый - 1,5; натрий хлористый - 10,0; глюкоза - 3,0; а также пеногаситель - 0,02 мл; ампициллин - 25 мг; канамицин - 75 мг; вода дистиллированная - до 1 литра. рН до стерилизации составляет - 7,8-7,0.

Стерилизацию проводят при 116°С в течение 40 мин. Контроль процесса культивирования проводят по показаниям оптической плотности среды. При достижении плотности 2,0-2,5 ед. в ферментер вносят спиртовой раствор индуктора: изопропил-бета-D-тиогалактозида (ИПТГ) из расчета 48 мг/дм³. При достижении оптической плотности 4,5-5,0 осуществляют сепарацию. Полученные клетки промывают, суспендируют в буфере, разрушают в гомогенизаторе и центрифугируют.

Микробиологическая характеристика полученного рекомбинанта

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. На агаре «Дифко» клетки образуют круглые гладкие колонии с ровными краями. При росте в жидкой питательной среде образуют интенсивную ровную муть.

Физико-химические признаки. Клетки растут в температурном диапазоне от 15° до 40°С, оптимум рН 7,4. В качестве источников углерода и других необходимых компонентов используются минеральные соли, казеин, пептон, дрожжевой автолизат и т.д.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к канамицину и ампициллину.

Хранение рекомбинантного штамма. По требованиям генной инженерии материнский штамм микроорганизма и рекомбинантная плазмида хранятся отдельно друг от друга во избежание спонтанных мутаций. Наработанный объем плазмиды хранят при 20°С в буфере ТЕ (10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Материнский штамм хранят согласно общепринятым методам хранения микробиологических штаммов.

Как видно из представленного описания, получен штамм-продуцент гибридного белка, обладающего стафилокиназной активностью, названный нами E.coli MZ08.

В соответствии с вышеизложенным предложенное изобретение решило задачу создания рекомбинантной ДНК, кодирующей белок, обладающий стафилокиназной активностью, который может быть выделен с использованием металлхелатирующей аффинной хроматографии из-за наличия 6 гистидинов в лидерной части. Кодирующая последовательность стафилокиназы приведена на фигуре 1.

Изобретение позволило создать штамм-продуцент стафилокиназы E.coli MZ08, обеспечивающий выход рекомбинантного белка до 20% по отношению к общему количеству белков.