Результат интеллектуальной деятельности: АССОЦИАЦИЯ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ БИОЭМУЛЬГАТОРЫ, ДЛЯ ДЕГРАДАЦИИ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ В ПОЧВАХ, ПРЕСНОЙ И МОРСКОЙ ВОДЕ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для деградации нефти и нефтепродуктов, в частности углеводородов нефти, при очистке почв, воды и морских акваторий от загрязнения нефтью и нефтепродуктами.

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas ftuorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1, который используют в качестве биопрепарата для борьбы с загрязнениями почвы нефтью и нефтепродуктами (RU 2191643, кл. В09С 1/10, 27.10.2002).

Недостатком ассоциации является неспособность к деградации нефти и нефтепродуктов при температуре ниже 12°С.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, включающий ассоциацию аэробных бактериальных культур Acidovorax delafleldii HT-1, Burkholderia caryophylii HT-4, Pseudomonas fluorescens biovar II HT-6, Citrobacter amalonaticus Ян-3-2, Pseudomonas fluorescens Ян-8-2, Serratia marcescens Ян-10-2 с титром живых клеток не менее 10¹⁰.

Недостатком ассоциации является неспособность к деградации нефти и нефтепродуктов в присутствии повышенной концентрации соли (3-5%).

Известна ассоциация, состоящая из R-диссоциантов штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, осуществляющая деградацию углеводородов нефти в широком диапазоне солености (0,05-10%) (оптимальная соленость среды 3-5%) и температур (8-35°С) (оптимальная температура 25-27°С). Данная ассоциация составляет основу биопрепарата «Родер» (RU 2174496, кл. C02F 3/34, 10.10.2001).

Недостатком микроорганизмов является неспособность продуцировать биоэмульгаторы (поверхностно-активные вещества природного происхождения), которые повышают эффективность биодеградации трудноразлагаемых фракций нефти.

Известна ассоциация микроорганизмов, включающая следующие микроорганизмы Ralstonia eutropha B2 (FERM P-16672), Aureobasidium pullulans B10 (FERM P-16674), Ralstonia eutropha T23 (FERM P-16671), Burkholderia pyrrocinia T26 (FERM P-16669), Ralstonia eutropha ×3 (FERM P-16673), Burkholderia pyrrocinia ×4 (FERM P-16670), которая может применяться для очистки от нефти и нефтепродуктов загрязненных территорий (JP 11266858, 05.10.1999).

Недостатком ассоциации является способность к деградации только моноароматических углеводородов (толуол, ксилол, бензол), входящих в состав нефти и неспособность к деградации полиароматических углеводородов.

Задача данного изобретения состоит в получении ассоциации штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы и способных к деградации нефти и нефтепродуктов в почве, пресной и морской воде при повышенной концентрации соли.

Технический эффект от использования предлагаемой ассоциации состоит в том, что деградация нефти и нефтепродуктов осуществляется при повышенной концентрации соли как при нормальной, так и при низкой температуре, кроме того, входящие в состав ассоциации штаммы бактерий продуцируют поверхностно-активные вещества (биоэмульгаторы).

Предлагается ассоциация бактерий родов Rhodococcus и Pseudomonas, включающая следующие штаммы бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д, Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д, Pseudomonas sp. BKM В-2387Д и Pseudomonas putida BKM В-2380Д, продуцирующие биоэмульгаторы, для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде.

Она предназначена для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде как при нормальной, так и при низкой температурах. Штаммы бактерий содержатся в ассоциации в равных количествах.

Штаммы бактерий, входящие в состав ассоциации, депонированы в Всероссийской коллекции микроорганизмов (BKM) под следующими номерами:

Rhodococcus sp. X5 - BKM Ас-2532Д,

Rhodococcus sp. S67 - BKM Ас-2533Д,

Pseudomonas sp. BS3962 - BKM В-2387Д,

Pseudomonas putida BS3961 - BKM В-2380Д.

Идентификация штаммов бактерий проведена путем определения частичной нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК.

Микроорганизмы, входящие в состав ассоциации, чувствительны к следующим антибиотикам: ампициллин, тетрациклин, налидиксовая кислота, эритромицин, новобиоцин, стрептомицин, канамицин, клафоран, рифампицин, хлорамфеникол.

Штамм бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д выделен из сточных вод резинотехнического завода.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные прямые, изогнутые палочки размером 0,7-0,8×1,6-2,8 мкм, часто культура распадается на кокковые формы. Культура неподвижна. На стандартных питательных средах (МПА, LB) через 48 часов образует мелкие, шероховатые колонии кремового цвета.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Растет в температурном диапазоне от 4°С до 30°С, оптимум 25°С. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Использует в качестве источника роста нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти. В дополнительных факторах роста микроорганизм не нуждается.

Штамм бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д выделен из почвы с территории автозаправочной станции.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные прямые, изогнутые палочки размером 0,7-0,8×1,6-2,8 мкм, часто культура распадается на кокковые формы. Культура неподвижна. На стандартных питательных средах (МПА, LB) через 48 часов образует мелкие, шероховатые колонии кремового цвета.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Растет в температурном диапазоне от 4°С до 30°С, оптимум 25°С. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Использует в качестве источника роста нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти. В дополнительных факторах роста микроорганизм не нуждается.

Штамм бактерий Pseudomonas sp. BKM В-2387Д выделен из почвы, загрязненной креозотом.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные прямые или изогнутые палочки размером 0,8-0,9×1,5-3 мкм. На стандартных питательных средах (МПА, LB, King В) образует круглые колонии 2-3 мм в диаметре, плоские, гладкие, края слегка неровные, белые, непрозрачные.

Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregersen (1978) - грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Катапазный тест положительный. Образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при +41°С. Не обладает способностью к денитрификации с образованием азота. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, сукцинат. Использует в качестве источника роста углеводороды бензоат, салицилат, нафталин, фенантрен, нефть и дизельное топливо. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl.

Генетические признаки.

Микроорганизм содержит конъюгативную плазмиду биодеградации ПАУ pNF142 размером 90 т.п.н. Наличие конъюгативной плазмиды, содержащей гены биодеградации ПАУ, способствует увеличению деградативного потенциала за счет распространения генов среди аборигенных микроорганизмов.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д выделен из очистных сооружений коксогазового комбината.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные прямые или изогнутые палочки размером 0,8-0,9×1,5-3 мкм. На стандартных питательных средах (МПА, LB, King В) образует круглые колонии 2-3 мм в диаметре, плоские, гладкие, края слегка неровные, белые, непрозрачные.

Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregersen (1978) - грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при +41°С. Не обладает способностью к денитрификации с образованием азота. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, сукцинат. Использует в качестве источника роста углеводороды бензоат, салицилат, нафталин, фенантрен, нефть и дизельное топливо. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl.

Генетические признаки.

Микроорганизм содержит две плазмиды размером 100 и 50 тпн. Плазмида pBS1141 размером 100 тпн содержит гены биодеградации нафталина и фенантрена, конъюгативна и относится к Р9 группе несовместимости. Наличие конъюгативной плазмиды, содержащей гены биодеградации ПАУ, в штамме бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д способствует увеличению деградативного потенциала за счет распространения генов среди аборигенных микроорганизмов.

Плазмида pBS1142 размером 50 тпн является криптической и не содержит генов биодеградации.

Отобранные микроорганизмы, входящие в состав ассоциации, способны утилизировать дизельное топливо, нефть, мазут или полициклические ароматические углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии при температуре от 4°С до 32°С.

Изучение способности микроорганизмов к росту на нефти и дизельном топливе в присутствии 3% NaCl при 24°С и 4-6°С показало (Табл.2), что в присутствии 3% NaCl микроорганизмы лучше растут на нефти, чем на дизельном топливе при 24°С и 4-6°С, т.е. способны деградировать не только легкие, но и тяжелые фракции нефти.

При росте на гексадекане эти микроорганизмы продуцируют биоэмульгаторы, повышающие эффективность биоутилизации нефти и нефтепродуктов. Исследование степени деградации нефти в жидкой минеральной среде показало, что индивидуальные штаммы бактерий способны деградировать от 15% до 26% нефти при 24°С в течение 7-10 суток и от 28% до 47% при 4-6°С в течение 10-20 суток (см. чертеж).

Пример 1.

Штаммы бактерий выращивают в колбах Эрленмейера со 100 мл минимальной среды Эванса, содержащей (г/л): К₂HPO₄ - 8,71 г; 5 М раствор NH₄Cl - 1 мл; 0,1 М раствор Na₂SO₄ - 1 мл; 62 мМ раствор MgCl₂ - 1 мл; 1 мМ раствор CaCl₂ - 1 мл; 0,005 мМ раствор (NH₄)₆Мо₇O₂₄·4Н₂O - 1 мл; микроэлементы - 1 мл (состав микроэлементов, г/л: ZnO - 0,41 г; FeCl₃·6Н₂O -5,4 г; MnCl₂·4H₂O - 2 г; CuCl₂·2H₂O - 0,17 г; CoCl₂·О - 0,48 г; Н₃ВО₃ - 0,06 г; рН 7) с добавлением нефти до конечной концентрации 1,65% весовых. Инокулирование колб с нефтью проводят суспензией микроорганизмов (10 мл на 100 мл среды, посевная доза 1-5×10⁷ кл/мл). После засева колбы помещают на круговую качалку (120 об/мин) и выращивают в течение 7-10 суток при температуре 24°С и в течение 10-20 суток при температуре 4-6°С.

В качестве контроля используют неинокулированную колбу со средой и нефтью. Степень деградации нефти определяют с помощью гравиметрического метода. У 4 отобранных микроорганизмов степень деградации нефти при 4-6°С выше (28-46%), чем при 24°С (15-26%).

Пример 2.

Культивирование ассоциации микроорганизмов и инокулирование выполняют как в Примере 1. Биомассу штаммов бактерий, входящих в состав ассоциации, берут в равных количествах из расчета, что посевная доза на колбу составляет 1-5×10⁷ кл/мл. Культивирование ассоциации проводят при 4-6°С в течение 10, 20 и 30 суток. Степень деградации нефти, определяемая с помощью гравиметрического метода, составляет от 20% до 45%. Степень деградации нефти возрастает с увеличением продолжительности эксперимента до 30 суток. Полученные данные подтверждают предположение о том, что для более эффективной деградации нефти в жидкой минеральной среде необходимо увеличить время эксперимента до 30 сут.

Пример 3.

Эмульгирующую активность штаммов бактерий определяют визуально согласно методике Broderic and Cooney по четырехбальной шкале и по изменению оптической плотности супернатанта с гексадеканом согласно методике Cirigliano and Carman в нашей модификации. 1 мл культуры, выращенной на среде Эванса с гексадеканом, центрифугируют в течение 3 минут при 12000 об/мин на микроцентрифуге «Beckman» (США). Супернатант (1 мл) переносят в пробирки, добавляют 1 мл фосфатного буфера и 0,5 мл гексадекана. Содержимое пробирки перемешивают на миксере в течение 2 мин. В качестве контроля используют 0,5 мл гексадекана в 2 мл фосфатного буфера. Оценку поверхностной активности проводят по оптической плотности исследуемых образцов на спектрофотометре ФЭК-56М-У42 при длине волны 540 нм и толщине кюветы 0,5 см. Как видно из данных табл. 1, все исследованные микроорганизмы обладают высокой эмульгирующей активностью.

Анализ полученных результатов позволяет отнести большинство штаммов бактерий к эндотипу, т.е. продуцируемые ими биоэмульгаторы связаны с клеточной стенкой и оптическая плотность культуральной жидкости после центрифугирования в присутствии гексадекана была низкой. Штамм бактерий Rhodococcus sp. ВКМ Ас-2533Д можно отнести к экзотипу, т.к. штамм бактерий выделяет биоэмульгаторы в культуральную жидкость. Как видно из приведенных данных, наличие в среде 3% NaCl приводит к уменьшению эмульгирующей активности, проявляемой микроорганизмами.

Таким образом, предложена ассоциация из четырех психротрофных микроорганизмов, продуцирующих биоэмульгаторы и способных к деградации нефти и нефтепродуктов при повышенной концентрации соли как при нормальных, так и при пониженных температурах.