СПОСОБ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АНАЛИТОВ В ОБРАЗЦЕ

Изобретение относится к медицинской технике, в частности к иммуноанализу, и может быть использовано для ранней диагностики различных заболеваний.

Для диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний в образце биологической жидкости, взятой у человека или животного, зачастую необходимо определять несколько специфичных для данного заболевания соединений (аналитов). В качестве аналитов могут выступать специфические антитела, вырабатываемые организмом при инфекционном заболевании, антигены, присущие возбудителю инфекционного заболевания, или аутоантитела, образующиеся к компонентам собственного организма. При этом возникают проблемы правильного выбора способа исследований с целью получения детектируемых визуально или инструментальными средствами сигналов, свидетельствующих о наличии упомянутых выше аналитов в пробе биологической жидкости.

Известен способ липосомального гомогенного иммуноанализа и средства для его осуществления (РСТ, патент 88/08982, класс МКИ G 01 N 33/542). Способ включает операции взаимодействия аналита (антигена), липосом, несущих первые антитела к антигену и содержащих внутри детектируемое вещество, вторичных антител к данному антигену (аналиту), третьих антител, способных прямо или косвенно связываться с вторичным антителом, освобождение детектируемого вещества из липосом в количестве, зависящем от количества аналита, в присутствии комплемента.

Недостатком способа является высокая стоимость, длительность и трудоемкость анализа.

Известен способ анализа образцов с использованием липосом с инкапсулированным внутрь детектируемым веществом (патент США 4.704.355, класс НКИ 435/6). В способе используется вариант гетерогенного анализа, сущность которого заключается в том, что определяемый аналит (антиген) приводят в контакт с твердым носителем, на котором иммобилизованы антитела, связывающиеся с определяемым аналитом, затем твердофазный носитель приводят в контакт с раствором, содержащим липосомы с инкапсулированным аденозинтрифосфатом (АТФ). Тестирование аналита осуществляют по взаимодействию освобожденного АТФ с люциферин-люциферазой, при этом свет эмиссии измеряют фотометром или люминометром. Анализ бактериальных и вирусных антигенов осуществляют на стрипах, мембранах, частицах.

Недостатком способа является использование в качестве маркера АТФ, который может присутствовать в исследуемой биологической жидкости так же, как и ингибиторы люциферин-люциферазы, что снижает точность измерений, а также использование операций отмывки от не связавшихся реагентов и примесей, что делает анализ более длительным и трудоемким и требует дополнительных средств для осуществления способа.

Известен способ гомогенного липосомального иммуноанализа образцов биологических жидкостей (РСТ, патент 86/04682, класс МКИ G 01 N 33/53). Сущность способа заключается в том, что аналит представляет собой растворимый антилиганд, который связывается непосредственно с молекулами лиганда, встроенного в мембрану липосом, образуя комплексы на поверхности липосом. В присутствии комплемента содержащие на поверхности специфичные комплексы липосомы лизируются, высвобождая инкапсулированную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, количество которой пропорционально количеству аналита, связавшегося с липосомами.

Недостатком использования в качестве маркера фермента, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, является снижение его активности в процессе получения липосом и их хранения в водной среде. Кроме того, использование дополнительной индикаторной системы реагентов для повышения чувствительности способа при регистрации активности фермента, включающей дихлориндофенол и феназинметасульфат, делает процедуру проведения анализа более длительной и трудоемкой, а такие компоненты реакционной смеси, как NAD⁺ и NADH, могут присутствовать в сыворотке крови и влиять на точность проведения анализа.

Известен способ количественного определения антигенов или антител (патент США 4.623.618, класс НКИ 435/6). Способ позволяет проводить одновременное количественное измерение нескольких антигенов или антител в тестируемом образце и используется для выявления инфекционных заболеваний, хронических нарушений печени, злокачественных опухолей, иммуноглобулинов человека (IgG, IgM и IgA), в диагностике рака и др., в тех случаях, когда в одном образце необходимо определить несколько аналитов. В способе используют несколько видов микрокапсул, каждый из которых связан только с одним типом антигена или антител, причем каждый вид микрокапсул имеет включенное внутрь детектируемое вещество, отличное для каждого вида микрокапсул, которое высвобождается при проведении реакции комплементзависимого лизиса и определяется количественно в растворе. Количество высвободившегося вещества пропорционально количеству детектируемого антигена (антитела) в исследуемом образце. В качестве детектируемых веществ используют аминокислоты, сахара, белки, пептиды, полисахариды, ферменты и т.п. соединения, имеющие различный молекулярный вес. В качестве детектирующего средства используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), а в качестве микрокапсул - тени эритроцитов барана.

Использование для детектирования ВЭЖХ увеличивает время проведения анализа и его стоимость, а тени эритроцитов, используемые в качестве микрокапсул, не предназначены для длительного хранения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ иммуноанализа, использующий липосомы и предназначенный для детектирования по крайней мере одного аналита в тестируемом образце (патент США 5.369.036, класс НКИ 436/523). Сущность способа заключается в том, что для определения, например, двух аналитов (антигенов) в пробе используют смесь липосом, в каждый тип из которых инкапсулированы различные детектируемые вещества и поверхности которых связаны с различными антителами или антигенами. Способ осуществляют на твердом носителе с иммобилизованным антигеном (антигенами). Наличие одного или другого аналита в образце регистрируют по изменению окраски компонентов реагентной смеси. В качестве детектируемых веществ могут быть использованы красители, водорастворимые или липофильные, поглощающие в видимой области (сульфородамин В, хромазурол S, акридины и др.), регистрация которых может быть проведена с помощью фотометров или визуально, либо вещества, обладающие флуоресцентными свойствами (фталоцианины, порфирины, хелаты лантанидов и др.), регистрация которых проводится с помощью инструментального анализа. В способе использован вариант гетерогенного анализа, что приводит к усложнению способа из-за наличия операций адсорбции антигенов или антител на твердом носителе и нескольких операций отмывок.

Способ не предназначен для определения нескольких аналитов в образце при наличии одного типа липосом.

Задачей является создание гомогенного способа ранней диагностики заболеваний человека и животных, основанного на использовании универсального, простого в изготовлении, дешевого реагента, сохраняющего свою активность в течение длительного времени.

Технический результат достигается предлагаемым изобретением.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце, включающем встраивание в мембрану липосом антигена и включение детектируемого вещества внутрь липосом, проведение лизиса в присутствии специфичного к антигену антитела и определение количества аналита в пробе по выходу детектируемого вещества из лизированных липосом, в мембрану липосом встраивают по крайней мере два антигена, а определение различных антигенов в образце осуществляют путем проведения серий реакций комплементзависимого лизиса с различными, специфичными к определяемым антигенам антителами.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную совокупности в заявляемой формуле изобретения. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию новизны.

Предлагаемое изобретение отличается от прототипа иным способом получения липосомального реагента и другой последовательностью операций. Встраивание в мембрану липосом по крайней мере двух антигенов и инкапсулирование внутрь липосом одного детектируемого вещества позволяет проводить определение нескольких аналитов (антигены или антитела) в образце при использовании одного реагента и одного детектируемого вещества, что позволяет упростить и удешевить осуществление способа. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию уровня техники.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (сальмонеллез, туляремия) человека и животных; в эпидемиологии - для оценки распространения инфекционных заболеваний среди работников животноводческих ферм, птицефабрик, пищевой и мясоперерабатывающей промышленности, имеющих постоянный контакт с животными и продуктами животноводства как потенциальными источниками инфекции для человека. Способ является доступным (детектируемое вещество, помещаемое внутрь липосом, - кальцеин, сульфородамин 101, сульфородамин В и специфические антисыворотки выпускаются отечественной промышленностью, липополисахариды могут быть получены в лабораторных условиях), экспрессным (время анализа 1-1,5 ч), гомогенным, что создает возможности его автоматизации, липосомальные реагенты стабильны при хранении в течение 6-8 месяцев при 4^oС. Способ может быть использован для мониторинга нескольких заболеваний. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.

На фиг. 1 показана калибровочная кривая для определения липополисахаридного антигена (AГ₁) F.tularensis; на фиг.2 показана калибровочная кривая для определения липополисахаридного антигена (АГ₂) S.typhimurium.

Способ осуществляют следующим образом.

При осуществлении способа проводят встраивание в мембрану липосом нескольких различных антигенов (АГ₁, АГ₂ и т.д.), включение детектируемого вещества (метки) внутрь липосом, проведение реакции комплементзависимого лизиса в присутствии исследуемого образца и специфичного для одного из определяемых антигенов антитела (AT₁, АТ₂ и т.д.) с последующим определением искомого антигена по выходу детектируемого вещества из лизированных под действием комплемента липосом. Содержание АГ₁ (или AT₁) в исследуемом образце пропорционально количеству образовавшихся на поверхности липосом комплексов AГ₁-AT₁, которые активируют комплемент, что сопровождается лизисом липосом и выходом встроенного в липосомы детектируемого вещества. Таким образом, содержание антигена (или антитела) в образце пропорционально количеству освобожденного детектируемого вещества. В качестве детектируемого вещества могут быть использованы различные водорастворимые флуоресцентные соединения (сульфородамин 101, сульфородамин В, кальцеин). Для определения всех искомых антигенов в образце проводят серию реакций с частями исследуемого образца в присутствии специфичных к каждому последующему определяемому антигену (АГ₂, АГ₃ и т.д.) антител (АТ₂, АТ₃ и т.д.).

Для повышения точности анализа, кроме проведения полной реакции в присутствии липосом, антител и комплемента (при определении антител) или липосом, антигена, антител и комплемента (при определении антигена), ставят ряд контролей на неспецифический лизис липосом в присутствии только комплемента, только антител, только антигена или только буферного раствора. Полный лизис липосом определяют после разрушения липосом дезоксихолатом натрия. Регистрируют интенсивность флуоресценции детектируемого вещества после проведения реакции комплементзависимого лизиса и в каждом контроле. При определении содержания антигена иммунный лизис (А₁) рассчитывают по уравнению
A₁={F6-[(F₃-F₁)+F₅]}/{F₂-[(F₃-F₁)+ F₄]}•100%, (1)
где F₁ - фоновая флуоресценция детектируемого вещества в образце липосом;
F₂ - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы, антитела и комплемент;
F₃ - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы и антитела;
F₄ - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы и комплемент;
F₅ - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы, антиген и комплемент;
F₆ - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы, антиген, антитела и комплемент.

При определении содержания антител иммунный лизис (А₂) рассчитывают по уравнению
A₂={F₂-[F₄+(F₃-F₁)]}/(F₇ - F₁)•100%, (2)
где F₁, F₂, F₃ и F₄ имеют те же обозначения, что и в уравнении (1), а F₇ - флуоресценция детектируемого вещества в образце после разрушения липосом дезоксихолатом натрия.

Пример 1. Получение липосомального реагента
Раствор липидов - яичный лецитин, холестерин, дицетилфосфат (в молярном соотношении 2:1,5:0,22) в смеси хлороформ, метанол (2:1 по объему) упаривают на роторном испарителе до образования липидной пленки. Полученную пленку липидов растворяют в 1,5 мл диэтилового эфира, добавляют 0,5 мл раствора, содержащего 100 мМ сульфородамина 101, липополисахарид (ЛПС) F.tularensis (АГ₁) из расчета 300 мкг на 1 мкмоль суммарного липида и ЛПС S.typhimurium (АГ₂), предварительно обработанный 0,1 N NaOH, из расчета 150 мкг на 1 мкмоль суммарного липида. Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука в дезинтеграторе при частоте 22 кГц 3-4 раза по 30 с. Эмульсию помещают в круглодонную колбу на 20 мл и упаривают на роторном испарителе при давлении 50 кПа до образования липосом, а затем при 25 кПа до полного удаления эфира. Невключившийся сульфородамин 101 отделяют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом Г-50, уравновешанной трис-солевым буфером (ТСБ), а затем центрифугируют при 100 000 g в течение 40 мин. Полученный липосомальный реагент в ТСБ сохраняется в концентрированном состоянии (4-6 мкмоль липида/мл) при +4^oС без утраты своей биологической активности в течение 6-8 месяцев.

Пример 2. Построение калибровочной кривой для определения липополисахаридного антигена (АГ₁) F.tularensis
Для построения калибровочной кривой готовят ряд разведений стандартного раствора ЛПС-AГ₁ (1 мг/мл ) в ТСБ. 10 мкл раствора АГ₁ (с учетом двух параллельных) каждой концентрации смешивают с 20 мкл АТ₁. Используют такое разведение АТ₁, которое дает 90-60% от максимального иммунного лизиса. Инкубируют 10 мин при комнатной температуре, затем добавляют по 20 мкл суспензии липосомального реагента, содержащего 10 нмолей суммарного липида, инкубируют 10 мин, добавляют 10 мкл ТСБ, содержащего 5 мМ MgCl₂ и 1,5 мМ CaCl₂, и 20 мкл комплемента, в качестве которого используют сыворотку морской свинки или кролика. Объем смеси доводят до 100 мкл ТСБ. Одновременно (с учетом двух параллельных) ставят контроли: липосомы только с ТСБ, липосомы только с AT₁, липосомы только с комплементом. Через 1 ч инкубации при 20-24^oС реакцию останавливают добавлением 3 мл ТСБ. Флуоресценцию в каждой пробе измеряют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волн эмиссии и возбуждения 585 и 620 нм соответственно. Расчет величины иммунного лизиса (А₁) проводят по уравнению (1). За 100% принимают величину иммунного лизиса липосом в отсутствии ЛПС. Строят кривую зависимости величины иммунного лизиса липосом (А₁ в %) от десятичного логарифма концентрации ЛПС-АГ₁ в растворе (фиг.1). Диапазон измеряемых концентраций ЛПС F.tularensis от 0,1 до 50 мкг/мл исходного раствора.

Пример 3. Построение калибровочной кривой для определения липополисахаридного антигена (АГ₂) S.typhimurium
Постановку реакции и расчет величины иммунного лизиса проводят, как описано в примере 2. Используют АТ₂ к S. typhimurium и растворы ЛПС S. typhimurium (АГ₂) в ТСБ. На фиг.2 представлена кривая зависимости иммунного лизиса (А₁ в %) липосом от десятичного логарифма концентрации ЛПС-АГ₂ в растворе. Диапазон измеряемых концентраций ЛПС S.typhimurium от 0,5 до 200 мкг/мл.

Пример 4. Количественное определение липополисахаридного антигена F. tularensis
Постановку реакции и расчет величины иммунного лизиса проводят, как описано в примере 2, за исключением того, что вместо раствора ЛПС известной концентрации вносят 10 мкл исследуемой пробы. Используют тоже разведение AT₁, что и в примере 2. Из полученных величин A₁ в % с помощью калибровочной кривой (фиг.1) находят концентрацию ЛПС-АГ₁.

Пример 5. Количественное определение липополисахаридного антигена S. typhimurium
Постановку реакции и расчет величины иммунного лизиса проводят, как описано в примере 3, за исключением того, что вместо раствора ЛПС известной концентрации вносят 10 мкл исследуемой пробы. Используют тоже разведение АТ₂, что и в примере 3. Из полученных величин А₁ в % с помощью калибровочной кривой (фиг.2) находят концентрацию ЛПС-АГ₂.

Пример 6. Определение в образце титра антител к F.tularensis (АТ₁)
Готовят ряд последовательных рабочих разведений АТ₁ на ТСБ от 1:2 до 1: 8192. В пробирки (с учетом двух параллельных) вносят по 20 мкл суспензии липосомального реагента, полученного по методу, приведенному в примере 1, содержащей 10 нмолей суммарного липида, 20 мкл AT₁ каждого разведения, инкубируют 10 мин, после чего вносят 10 мкл ТСБ, содержащего 5 мМ MgCl₂ и 1,5 мМ CaCl₂, и 20 мкл комплемента. Объем смеси доводят до 100 мкл ТСБ. Одновременно (с учетом двух параллельных) ставят контроли: липосомы в ТСБ, липосомы с АТ₂, липосомы с комплементом, а также определяют полный лизис липосом после их обработки 4% дезоксихолатом натрия. Через 1 ч инкубации при 20-24^oС реакцию останавливают 3 мл ТСБ. Флуоресценцию в каждой пробе измеряют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волн эмиссии и возбуждения 585 и 620 нм соответственно. Расчет величины иммунного лизиса (А₂) проводят по уравнению (2). За титр АТ₁ принимают минимальное разведение образца, дающее 10%-ный иммунный лизис липосом.

В таблице 1 приведены результаты определения величин иммунного лизиса липосом, соответствующих определенным разведениям образца АТ₁.

Из данных таблицы 1 видно, что титр AT₁ составляет ~1:40000.

Пример 7. Получение иммунного лизиса липосом в присутствии антител к S. typhimurium (АТ₂)
Готовят ряд последовательных рабочих разведений АТ₂ на ТСБ от 1:2 до 1: 32. Далее постановку реакции и расчет иммунного лизиса липосом проводят, как описано в примере 3. В таблице 2 приведены результаты определения величин иммунного лизиса липосом, соответствующих определенным разведениям образца АТ₂.

Из данных таблицы 2 видно, что титр АТ₂ составляет ~1:80.