4-(3,4-Дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0,0]додекан в качестве противосудорожного средства

Изобретение относится к фармацевтической химии и фармакологии, а именно к применению 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (тиовюрцин), обладающего противосудорожной активностью:

Судороги - приступообразные непроизвольные сокращения скелетной мускулатуры. Они могут быть симптомами ряда заболеваний (менингит, энцефалит, черепно-мозговые травмы, эпилепсия, отек мозга и другие) или результатом вторичных изменений в центральной нервной системе, возникающих после общих инфекций и отравлений, при нарушении обмена веществ, в частности, при дефиците витамина В₆, недостатке кальция и так далее. Часто судороги связаны с систематическим переутомлением мышц, например, у спортсменов, машинисток, скрипачей. Судороги иногда возникают у здоровых людей при купании в холодной воде или во время ночного сна. Существует большое количество противосудорожных средств (барбитураты, транквилизаторы), которые ослабляют процессы возбуждения или усиливают процессы торможения в центральной нервной системе, а также специальные противосудорожные препараты, назначаемые при эпилепсии, болезни Паркинсона, паркинсонизме, тиках и других заболеваниях (фенобарбитал, бензодиазепины, клоназепам, диазепам и лоразепам, вальпроевая кислота и вальпроат натрия, вигабатрин, ламотриджин, фенитоин, карбамазепин, вальпроевая кислота и вальпроат натрия). Противосудорожное средство должно соответствовать следующим требованиям: обладать высокой активностью и большой продолжительностью действия, чтобы надолго предотвращать приступы, проявлять эффективность при разных видах эпилепсии, так как нередко встречаются смешанные формы болезни, отсутствие успокаивающих, снотворных, аллергических и других свойств (эти вещества принимают в течение нескольких месяцев и

даже лет), проявлять неспособность накапливаться, вызывать привыкание и лекарственную зависимость [3].

Одним из наиболее часто используемых и наиболее близким по техническому результату к предлагаемому средству является карбамазепин, который выбран в качестве препарата сравнения [3]. Карбамазепин, получивший широкое распространение при лечении различных форм эпилепсии, блокирует натриевые каналы в клетке. Преимуществом его является положительное воздействие на психику: улучшается настроение, повышается активность и общительность пациентов, а это облегчает их социальную и профессиональную реабилитацию. Однако, нарушение пищеварения, головная боль, головокружение, сонливость, угнетение психомоторных реакций в результате приема карбамазепина являются противопоказаниями для назначения водителям, операторам машин и людям аналогичных профессий. Кроме того, при приеме препарата необходимо проведение регулярных анализов крови, так как возможно уменьшение числа лейкоцитов или тромбоцитов в крови.

Существуют противопоказания и ограничения к назначению большинства остальных противосудорожных средств [3].

Нами впервые выявлена выраженная противосудорожная активность 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (тиовюрцин), относящегося к 4 классу опасности - «малотоксичные средства».

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала малотоксичных противосудорожных средств применением вещества тиовюрцин, молекула которого является первой в своем классе веществ [2]. Прямых аналогов разрабатываемого лекарственного средства на основе производных 2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло [5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана для противосудорожной терапии пока не существует [4, 7]. Приоритет оригинальности данной молекулы подтвержден патентом №2565766 РФ «4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил2,4,6,8,10,12гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекан в качестве анальгетического средства и способ его получения» (23.09.2015).

Поставленная задача достигается применением 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (тиовюрцин) в качестве противосудорожного средства.

Соединение представляет собой каркасный полиамид - производное 2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана. Получен впервые ацилированием промышленно доступного 2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана хлорангидридом 3,4-дибромтиофенкарбоновой кислоты [2, 7].

Техническим результатом предлагаемого изобретения является выявление противосудорожного действия нового малотоксичного противосудорожного средства.

Предлагаемое в качестве изобретения противосудорожное средство 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана синтезировано в ФГБУН Институте проблем химико-энергетических технологий СО РАН (Бийск). Прототип на вещество отсутствует.

В ФГБУ НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ при проведении экспериментальных исследований выявлена выраженная противосудорожная активность данного средства.

Новое свойство, предлагаемого в качестве противосудорожного средства, явным образом не вытекает из уровня техники в данной области и неочевидно для специалиста.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается примером конкретного выполнения исследования противосудорожной активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (тиовюрцин) в сравнении с референс препаратом карбамазепином, доказывающего, что новые признаки решают поставленную задачу.

Пример.

Исследование противосудорожной активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана в сравнении с референс препаратом карбамазепином в условиях модели «коразоловые судороги».

Первым этапом выявления потенциальных противоэпилептических препаратов является оценка противосудорожных свойств тестируемых веществ в скрининговых исследованиях на модели первично-генерализованной эпилепсии, включающей судороги, вызванные химическим воздействием (тест антагонизма с коразолом) у мышей и крыс [2]. Судороги, вызываемые подкожным введением коразола, моделируют «малые, petit mal» припадки.

Эксперименты были выполнены на 60 аутбредных мышах-самцах CD1 (7-8 недель, масса 20 г) первой категории конвенциональных, полученных из отдела экспериментального биомоделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (сертификат здоровья животных, ветеринарное удостоверение 270 №0008633). Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены Биоэтическим комитетом НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (протокол JACUC №96092015) и соответствовали директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [1]; Приказу МЗ РФ от 1 августа 2016 N 199н.

Каждому животному внутри группы присваивали индивидуальный номер от 1 до 10, помечаемый с помощью меток фукорцином. Мышей распределяли на группы рандомизированно, используя в качестве критерия массу тела, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения в пределах одного пола более чем на ± 10%. Данные (вес и номер) отобранных животных ранжировали в порядке убывания веса, используя для этого компьютерную программу Excel, имеющую команду SORT.

Статистическая обработка полученных результатов проведена методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения Statistica 6.0. Для всех данных подсчитаны среднее значение (X) и стандартная ошибка среднего (m), которые вместе со значением n (количество вариант в группе) представлены в итоговых таблицах. Различие сравниваемых величин считали достоверным в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5% (Р<0,05). Используя выборочные коэффициенты асимметрии и эксцесса, оценивали степень приближения закона распределения исследуемого признака к нормальному. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараметрический критерий U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни. Для выявления достоверности различий качественных показателей использовали критерий углового преобразования Фишера [3].

Модель судорог, вызванных коразолом при его подкожном введении

Исследования проводят на аутбредных белых мышах-самцах CD1 или мышах Crl:NMRI BR) массой 21-26 г. Каждая доза испытывается не менее, чем на 10 животных. Коразол вводится в дозе 140 мг/кг подкожно в область шейного отдела спины. Животные наблюдаются в течение 30-60 мин после инъекции коразола с регистрацией основного показателя - первых генерализованных клонических судорог с утратой рефлекса переворачивания [3]. На основе этих данных рассчитывается доза, вызывающая судороги у 97% животных (СД97). Эта доза может колебаться в зависимости от качества коразола от 50 до 120 мг/кг. После введения дозы СД97 у всех контрольных животных развиваются судорожные проявления в следующей последовательности.

1. Одно или более миоклонических подергиваний всего тела.

2. Повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания.

3. Генерализованные клонические судороги передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания.

4. Тоническая экстензия передних конечностей с потерей рефлекса переворачивания.

5. Тоническая экстензия передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания.

У 90-100% контрольных животных после введения коразола обязательно должны наблюдаться судорожные проявления, описанные в пунктах 1-3. Для определения противосудорожной активности нового исследуемого соединения коразол вводят после соединения на пике его максимального эффекта и затем осуществляют регистрацию судорог в течение 30-60 мин. Животные, у которых не наблюдаются после введения вещества и затем коразола судороги в течение 30 мин, описанные в пункте 2 - повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания или судороги последующих 3-5 стадий - рассматриваются как защищенные [3].

Соединение применяли в дозах 50, 100 и 200 мг/кг внутрижелудочно через зонд однократно за 1 ч до введения коразола (140 мг/кг). Карбамазепин применяли в дозе 100 мг/кг внутрижелудочно через зонд однократно. Животные контрольной группы получали растворитель (вода очищенная с твином 80) в аналогичном режиме и пути введения.

Выявлена противосудорожная активность нового вещества 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (тиовюрцин), превосходящая по ряду показателей эффективность карбамазепина (таблица 1). Продемонстрировано, что превентивное однократное внутрижелудочное через зонд применение тиовюрцина в дозе 100 мг/кг приводило к статистически достоверному снижению количества миоклонических судорог относительно аналогичного значения группы карбамазепина, сравнительному повышению продолжительности жизни животных, при этом превосходило по основному показателю эффективности противосудорожного действия - увеличению количества выживших животных (41,7% относительно 33,3% группы карбамазепина).

Таким образом, на скрининговом этапе выявления потенциальных противоэпилептических препаратов в тесте с коразолом, моделирующем судороги, было установлено по совокупности данных, что соединение снижает количество судорожных приступов, увеличивает латентное время развития судорог, увеличивает продолжительность жизни и защищает животных от гибели. Механизм противосудорожного действия, вероятно, может быть обусловлен как аллостерическими взаимодействиями с компонентами ГАМК-_A рецепторного комплекса [5], так и влиянием на Са²⁺-зависимые-K⁺ токи [6].

Список используемой литературы

1. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях (пер. с англ.). - С.П., 2012. - 48 с.

2. Патент №2565766 Российской Федерации, МПК CO7D А61Р. 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекан в качестве анальгетического средства и способ его получения [Текст] / Крылова С.Г., Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., Рыбалкина О.Ю., Лопатина К.А., Сысолятин С.В., Калашников А.И., Малыхин В.В., Дыгай A.M., Жданов В.В., Ворожцов А.Б., Жуков А.С.; патентообладатели: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга» (RU), Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук (ИП ХЭТ СО РАН) (RU), №2014146024/04; заявл. 17.11.2014; зарег. 23.09.2015.; опубл. Бюлл. №29 20.10.2015.

3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К», 2012.

4. Толстикова Т.Г., Морозова Е.А., Сысолятин С.В., Калашников А.И., Жукова Ю.И., Сурмачев В.Н. Синтез и биологическая активность производных 2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана // Химия в интересах устойчивого развития. - 2010. - №18. - С. 511-516.

5. Birnir, В. Bicuculline, pentobarbital and diazepam modulate spontaneous GABA(A) channels in rat hippocampal neurons / B. Birnir, M. Eghbali, A.B. Everitt, P.W. Gage // Br. J. Pharmacol. - 2000. - 131(4). - P. 695-704.

6. Pflieger, J.F. Picrotoxin and bicuculline have different effects on lumbar spinal networks and motoneurons in the neonatal rat / J.F. Pflieger, F. Clarac, L. Vinay // Brain Res. - 2002. - 935(1-2). - P. 81-86.

7. Sergey V. Sysolyatin, Alexander I. Kalashnikov, Valeriy V. Malykhin, Irina A. Surmacheva, Gennady V. Sakovich. Reductive Debenzelation of 2,4,6,8,10,12 - Hexaazaisowurtzitane // International Journal of Energetic Materials and Chemical Propulsion - 2010. - V. 9. - №4 - P. 365.