Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ПЦР-АНАЛИЗА И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к медицине и биологии и предназначено для использования при проведении ПЦР-исследований.

Из практики лабораторных исследований известно, что мультиплексная ПЦР имеет ряд преимуществ перед стандартной, более простой униплексной ПЦР: снижение риска контаминации образца, возможность контроля ложноотрицательных результатов, уменьшение расхода реактивов, сокращение времени подготовки, более высокое качество эталона, количество которого можно определить в образце (Edwards M.C., Gibbs R.A. Multiplex PCR: advantages, development, and applications // PCR methods and applications. - 1994. - Vol. 3, № 4. - P. S65-S75; Multiplex PCR [Электронный ресурс]. - URL: http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html (дата обращения: 03.09.2011); Elnifro E.M., Ashshi A.M., Cooper R.J., Klapper P.E. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology // Clinical microbiology reviews. - 2000. - Vol. 13, № 4. - P. 559-570).

Продолжительность (время проведения) мультиплексной ПЦР при использовании известных способов длительная и составляет 1,5-8 часов (Successful PCR Guide. 3rd Edition. Takara [Электронный ресурс] // Scientifix. - URL: http://www.scientifix.com.au/pdf/catalogues/TaKaRa%20Successful%20PCR%20Guide%203rd%20ed.pdf (дата обращения: 14.11.2011); Performing Fast PCR Using Bio-Rad Thermal Cyclers [Электронный ресурс] // Bio-Rad. - URL: http://www3.bio-rad.com/gexp/html/applications/profiling/ap12_fastpcr.pdf (дата обращения: 14.11.2011); Techne TC-PLUS thermal cycler is ideal for new fast PCR protocols [Электронный ресурс] // Techne. - URL: http://www.techne.com/news.asp?dsl=590 (дата обращения: 15.11.2011);
Fast PCR [Электронный ресурс] // Invitrogen. - URL: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-Expression-Profiling/PCR/PCR-Misc/Fast-PCR.html (дата обращения: 15.11.2011).

Вне зависимости от используемых праймеров в мультиплексной ПЦР преимущественно используется буфер на основе трис-HCl в различных разведениях (патент RU 2164532 от 27.03.2001; Mahony J.B., Song X., Chong S. [et al.]. Evaluation of the NucliSens Basic Kit for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genital tract specimens using nucleic acid sequence-based amplification of 16S rRNA // Journal of clinical microbiology. - 2001. - Vol. 39, № 4. - P. 1429-1435; патент US 2009111134 от 30.04.2009).

Основными недостатками известных наиболее широко используемых вариантов мультиплексной ПЦР являются возможность получения ложных результатов при достаточных различиях концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней, сравнительно большая продолжительность ПЦР и отсутствие оптимизации состава буфера для постановки реакции с комплексным учетом особенностей состава основных реагентов ПЦР: свойств и соотношения неблокированных и модифицированных праймеров и Taq-полимеразы.

Применение быстрого ПЦР (fast PCR) ограничено в диагностических целях в связи с неэффективной амплификацией низкокопийных мишеней (Hilscher C., Vahrson W., Dittmer D.P. Faster quantitative real-time PCR protocols may lose sensitivity and show increased variability // Nucleic Acids Research. - 2005. - Vol. 33, № 21. - e182 doi:10.1093/nar/gni181).

Известно использование для репликации нуклеиновых кислот реакционной буферной композиции, содержащей неорганическую соль и сульфат аммония в молярных соотношениях от 5:1 до 240:1 соответственно (патент US 2008038782 от 14.02.2008). В известной композиции в качестве неорганических солей, например, могут использоваться сульфат калия, хлористый калий, азотнокислый калий, хлористый магний, хлорид цезия и нитрат цезия. Кроме того, известная композиция может дополнительно содержать трис-сульфатный буфер, сульфат магния и тритон X-100. Согласно описанию данного аналога известная реакционная буферная композиция позволяет использовать в ПЦР более высокую (до 25 раз) концентрацию ДНК-полимеразы (Pfu или Taq-полимеразы), за счет чего увеличивается выход продукта амплификации и ускоряется кинетика реакции.

Основными недостатками данного аналога являются возможность получения ложных результатов при достаточных различиях концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней, увеличение расхода реагентов и отсутствие оптимизации состава буфера для постановки реакции с комплексным учетом особенностей состава основных реагентов ПЦР: свойств и соотношения неблокированных и модифицированных праймеров и Taq-полимеразы.

Для повышения качества ПЦР (в том числе мультиплексной ПЦР) предложено в состав буфера для постановки реакции на основе трис-HCl буфера или трис-гепес буфера включать глютамат калия, который обеспечивает усиление взаимодействия между ферментом и ДНК и, соответственно, увеличение продукта ПЦР-амплификации (Knorr A., Turner R.T., Bolander M.E., Sarkar G. Stimulatory effect of potassium glutamate in PCR // PCR methods and applications. - 1993. - Vol. 3, № 1. - P. 73-74; патент WO 03048391 от 12.06.2003).

Основными недостатками данного аналога являются возможность получения ложных результатов при достаточных различиях концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней и отсутствие оптимизации состава буфера для постановки реакции с комплексным учетом особенностей состава основных реагентов ПЦР: свойств и соотношения неблокированных и модифицированных праймеров и Taq-полимеразы.

Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения - прототипом является способ модуляции амплификации последовательностей-мишеней в мультиплексном температурном цикле синтеза ДНК полимеразой с использованием реакционной смеси, включающей одну или более неблокированную пару праймеров и один или более модифицированный праймер (патент US 6057134 от 02.05.2000). При этом модифицированные праймеры изменены так, чтобы предотвращать их включение в синтез ДНК полимеразой. Согласно прототипу у модифицированных праймеров 3'-концевая гидроксильная группа химически изменена добавлением фосфата, биотина, дигоксигенина, флуоресценина, дидезоксинуклеотида, амина, тиола, азо- (N₃) группы или фтора. Известный способ при мультиплексной ПЦР позволяет регулировать эффективность амплификации имеющейся в изобилии мишени, не подавляя амплификацию других мишеней. В соответствии с прототипом в качестве буфера в мультиплексной ПЦР с неблокированными и модифицированными праймерами используется ПЦР-буфер, содержащий 10 мМ трис-HCl pH 8,3, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂.

Основными недостатками прототипа являются сравнительно большая продолжительность мультиплексной ПЦР и отсутствие оптимизации состава буфера для постановки реакции с комплексным учетом особенностей состава основных реагентов ПЦР: свойств и соотношения неблокированных и модифицированных праймеров и Taq-полимеразы.

Главной задачей, решаемой заявляемым техническим решением, является уменьшение продолжительности мультиплексной ПЦР без повышения концентрации Taq-полимеразы при предотвращении получения ложных результатов, связанных с различиями концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней.

Поставленная задача реализуется за счет того, что после выделения ДНК из биологического или клинического материала проводят мультиплексную ПЦР с первыми 5÷10 циклами амплификации в виде трехшаговой ПЦР и с последующими 25÷35 циклами амплификации в виде двухшаговой ПЦР в буфере для постановки реакции, содержащем катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с рН 7,0÷7,5 при 40÷85°С, включающей соль глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту, при соотношении количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им праймеров с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце (остаток дидезоксинуклеотида в праймере обозначают как ddN: остаток дидезоксиаденозинмонофосфата - ddA, остаток дидезоксицитидинмонофосфата - ddC, остаток дидезоксигуанозинмонофосфата - ddG и остаток дидезокситимидинмонофосфата - ddT), составляющем 3:1. Набор для осуществления заявляемого способа содержит неблокированные прямые и обратные праймеры, гомологичные им прямые и обратные праймеры с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце, термостабильный фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, положительные контроли, отрицательные контроли, воск, масло для проведения ПЦР и буфер для постановки реакции, содержащий катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с рН 7,0÷7,5 при 40÷85°С, включающей соль глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту.

При этом один из основных компонентов буферной системы - трис(гидроксиметил) аминометан - используют в известных, применяемых в ПЦР концентрациях (Компоненты PCR смеси [Электронный ресурс]. - URL: http://molbiol.edu.ru/protocol/12_01.html (дата обращения: 05.09.2011); PCR Buffers (A to W) [Электронный ресурс]. - URL: http://york-bio.com/pcr%20related.htm (дата обращения: 05.09.2011); 5X Long PCR Buffer [Электронный ресурс]. - URL: http://130.15.90.245/5x_long_pcr_buffer.htm (дата обращения: 05.09.2011); GeneAmp PCR Buffers [Электронный ресурс]. - URL: http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/pcropt/ (дата обращения: 05.09.2011); productPDF_50328 [Электронный ресурс]. - URL: http://www.thermo.fr/eThermo/CMA/PDFs/Product/productPDF_50328.pdf (дата обращения: 05.09.2011); 10x PCR Buffer [Электронный ресурс]. - URL: http://www.allelebiotech.com/content/pdf/10x_PCR_Buffer.pdf (дата обращения: 05.09.2011); 10X Buffer Cfr9I [Электронный ресурс]. - URL: http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/buffers/b02-buffer-cfr9i (дата обращения: 05.09.2011); Knorr A., Turner R.T., Bolander M.E., Sarkar G. Stimulatory effect of potassium glutamate in PCR // PCR methods and applications. - 1993. - Vol. 3, № 1. - P. 73-74; патент WO 03048391 от 12.06.2003; патент WO 2008013885 от 31.01.2008; патент US 2009325278 от 31.12.2009).

Другие основные ингредиенты буферной системы - ортофосфорную кислоту и соль глутаминовой кислоты - используют в концентрациях, обеспечивающих рН 7,0÷7,5 при 40÷85°С с учетом концентрации трис(гидроксиметил)амино-метана, а соль глутаминовой кислоты выбирают из ряда: глутамат калия, глутамат натрия или их смесь.

В качестве известных применяемых в ПЦР донаторов катионов калия (I) используют в известной концентрации, по меньшей мере, одну соль, выбранную из ряда: хлорид калия, сульфат калия и ацетат калия. В качестве известных применяемых в ПЦР донаторов катионов магния (II) используют в известной концентрации, по меньшей мере, одну соль, выбранную из ряда: хлорид магния, сульфат магния и ацетат магния. В состав буфера для постановки реакции могут быть дополнительно включены любые другие известные реагенты, используемые в ПЦР-буфере
(Компоненты PCR смеси [Электронный ресурс]. - URL: http://molbiol.edu.ru/protocol/12_01.html (дата обращения: 05.09.2011); PCR Buffers (A to W) [Электронный ресурс]. - URL: http://york-bio.com/pcr%20related.htm (дата обращения: 05.09.2011); 5X Long PCR Buffer [Электронный ресурс]. - URL: http://130.15.90.245/5x_long_pcr_buffer.htm (дата обращения: 05.09.2011); GeneAmp PCR Buffers [Электронный ресурс]. - URL: http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/pcropt/ (дата обращения: 05.09.2011); productPDF_50328 [Электронный ресурс]. - URL: http://www.thermo.fr/eThermo/CMA/PDFs/Product/productPDF_50328.pdf (дата обращения: 05.09.2011); 10x PCR Buffer [Электронный ресурс]. - URL: http://www.allelebiotech.com/content/pdf/10x_PCR_Buffer.pdf (дата обращения: 05.09.2011); 10X Buffer Cfr9I [Электронный ресурс]. - URL: http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/buffers/b02-buffer-cfr9i (дата обращения: 05.09.2011);
10X PCR Buffer [Электронный ресурс]. - URL: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&N4=P2192|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC (дата обращения: 06.09.2011); PCR Amplification [Электронный
ресурс]. - URL: http://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/pcr-amplification/ (дата обращения: 06.09.2011); Knorr A., Turner R.T., Bolander M.E., Sarkar G. Stimulatory effect of potassium glutamate in PCR // PCR methods and applications. - 1993. - Vol. 3, № 1. - P. 73-74; патент WO 03048391 от 12.06.2003; патент WO 2008013885 от 31.01.2008; патент US 2009325278 от 31.12.2009).

В основу заявляемого изобретения положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков. Во-первых, это новая оригинальная буферная система для мультиплексной ПЦР, которая за счет более стабильной рН при смене температур этапов (шагов) циклов амплификации расширяет температурный интервал как отжига неблокированных прямых и обратных праймеров, так и гомологичных им прямых и обратных праймеров с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце, поддерживая также высокую активность Taq-полимеразы. Во-вторых, это новое сочетание оригинального буфера для постановки мультиплексной ПЦР с неблокированными прямыми и обратными праймерами с гомологичными им прямыми и обратными праймерами с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце, расширяющее перечень используемых праймеров, снижающее конкуренцию праймеров за Taq-полимеразу и нуклеозидтрифосфаты, что в сочетании, в свою очередь, повышает скорость мультиплексной ПЦР без повышения концентрации ДНК-полимеразы при предотвращении получения ложных результатов. Другие обязательные компоненты (K⁺ и Mg²⁺) нового буфера для постановки мультиплексной ПЦР усиливают эти полезные свойства оригинальной буферной системы при использовании смеси неблокированных прямых и обратных праймеров и гомологичных им прямых и обратных праймеров с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце. В-третьих, это подобранное с учетом свойств буферной системы и концентрации Taq-полимеразы соотношение количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им праймеров с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце. В-четвертых, это впервые использованное на стандартном термоциклере сочетание трехшаговой ПЦР, позволяющей накопить начальные мишени, и двухшаговой ПЦР, позволяющей снизить время проведения амплификации, в том числе при использовании нового буфера, неблокированных прямых и обратных праймеров и гомологичных им прямых и обратных праймеров с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце.

Из патентно-технической литературы и практики ПЦР-исследований неизвестно о способе мультиплексного ПЦР-анализа и наборе для его осуществления, которые были бы идентичны заявляемым.

Отсюда правомерен вывод о соответствия заявляемого решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - уменьшения продолжительности мультиплексной ПЦР без повышения концентрации Taq-полимеразы при предотвращении получения ложных результатов, связанных с различиями концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней. Между существующими признаками и решаемой задачей существует причинно-следственная связь, где каждый признак необходим и влияет на получение технического результата, а вместе взятые признаки достаточны для его получения. Правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ может быть реализован многократно, а значит заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Предлагаемый способ апробирован в лаборатории иммунологии и вирусологии, группе молекулярной биологии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института медицинской приматологии Российской академии медицинских наук.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, полученных при апробации предлагаемого способа, показывающих повышение скорости мультиплексной ПЦР без повышения концентрации ДНК-полимеразы, при предотвращении получения ложных результатов, связанных с различиями концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней, при использовании заявляемого способа. При этом приведенные примеры мультиплексного ПЦР-анализа и вариантов набора для его осуществления показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан анубис, инфицированной Chlamydia trachomatis, Mycoplasma homonis и Mycoplasma genitalium, с превалированием в микст-инфекции в качестве инфекционного агента Chlamydia trachomatis). Затем проводили мультиплексную ПЦР с первыми 10 циклами амплификации в виде трехшаговой ПЦР и с последующими 25 циклами амплификации в виде двухшаговой ПЦР с использованием набора, содержащего неблокированные прямые и обратные праймеры для Chlamydia trachomatis, Mycoplasma homonis и Mycoplasma genitalium, гомологичные им прямые и обратные праймеры с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце:

праймеры для выявления Chlamydia trachomatis:

прямой неблокированный -

CTF 5'-GCA AGA TAT CGA GTA TGC GTT GTT AGG-3',

обратный неблокированный -

CTR 5'-TTC ATT GTA CTC ATT AAA CGA GGC GG-3',

прямой, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

CTFb 5'-GCA AGA TAT CGA GTA TGC GTT GTT AGddG,

обратный, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

CTRb 5'-TTC ATT GTA CTC ATT AAA CGA GGC GddG;

праймеры для выявления Mycoplasma homonis:

прямой неблокированный -

MHF 5'-ATA CAT CGA TGT CGA GCG AG-3',

обратный неблокированный -

MHR 5'-CAT CTT TTA GTG GCG CCT TAC-3',

прямой, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

MHFb 5'-ATA CAT CGA TGT CGA GCG AddG,

обратный, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

MHRb 5'-CAT CTT TTA GTG GCG CCT TAddC;

праймеры для выявления Mycoplasma genitalium:

прямой неблокированный -

MgPaW1* 5'-AAG TGG AGC GAT CAT TAC TAA C-3',

обратный неблокированный -

MgPaR1 5'-CCG TTG TTA TCA TAC CTT CTG A-3',

прямой, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

MgPaW1*b 5'-AAG TGG AGC GAT CAT TAC TAA ddC,

обратный, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

MgPaR1b 5'-CCG TTG TTA TCA TAC CTT CTG ddA.

Набор также содержал термостабильный фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), положительные контроли, отрицательные контроли, воск, масло для проведения ПЦР и буфер для постановки реакции, содержащий катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с рН 7,0÷7,5 при 40÷85°С, включающей глутамат калия в качестве соли глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту. Мультиплексную ПЦР проводили при соотношении количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им праймеров с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце, составляющем 3:1.

При этом концентрация Taq-полимеразы, используемая в мультиплексной ПЦР, не превышала ее концентрации, требуемой для проведения униплексной ПЦР с аналогичными парами праймеров, и составила 1,5 е.а. в реакционной смеси.

Продолжительность (время проведения) мультиплексной ПЦР при использовании многоканального амплификатора «Терцик» (Многоканальный амплификатор «Терцик» [Электронный ресурс]. - URL: http://www.dna-technology.ru/dnaproducts/equipments/mamplificators/tercik/ дата обращения: 17.11.2011)) составила 60 минут.

В результате проведения мультиплексной ПЦР по заявляемому способу и с использованием заявляемого набора была установлена положительная ПЦР с праймерами для Chlamydia trachomatis, Mycoplasma homonis и Mycoplasma genitalium.

Пример 2. Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Chlamydia trachomatis, Mycoplasma homonis и Ureaplasma urealyticum, с превалированием в микст-инфекции в качестве инфекционного агента Mycoplasma homonis). Затем проводили мультиплексную ПЦР с первыми 5 циклами амплификации в виде трехшаговой ПЦР и с последующими 30 циклами амплификации в виде двухшаговой ПЦР с использованием набора, содержащего неблокированные прямые и обратные праймеры для Chlamydia trachomatis, Mycoplasma homonis и Ureaplasma urealyticum, гомологичные им прямые и обратные праймеры с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце:

праймеры для выявления Chlamydia trachomatis:

прямой неблокированный -

CTF 5'-GCA AGA TAT CGA GTA TGC GTT GTT AGG-3',

обратный неблокированный -

CTR 5'-TTC ATT GTA CTC ATT AAA CGA GGC GG-3',

прямой, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

CTFb 5'-GCA AGA TAT CGA GTA TGC GTT GTT AGddG,

обратный, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

CTRb 5'-TTC ATT GTA CTC ATT AAA CGA GGC GddG;

праймеры для выявления Mycoplasma homonis:

прямой неблокированный -

MHF 5'-ATA CAT CGA TGT CGA GCG AG-3',

обратный неблокированный -

MHR 5'-CAT CTT TTA GTG GCG CCT TAC-3',

прямой, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

MHFb 5'-ATA CAT CGA TGT CGA GCG AddG,

обратный, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

MHRb 5'-CAT CTT TTA GTG GCG CCT TAddC;

праймеры для выявления Ureaplasma urealyticum:

прямой неблокированный -

U5 5'-CAA TCT GCT CGT GAA GTA TTA C-3',

обратный неблокированный -

U4 5'-ACG ACG TCC ATA AGC AAC T-3',

прямой, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

U5b 5'-CAA TCT GCT CGT GAA GTA TTA ddC,

обратный, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

U4b 5'-ACG ACG TCC ATA AGC AAC ddT.

Набор также содержал термостабильный фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), положительные контроли, отрицательные контроли, воск, масло для проведения ПЦР и буфер для постановки реакции, содержащий катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с рН 7,0÷7,5 при 40÷85°С, включающей глутамат натрия в качестве соли глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту. Мультиплексную ПЦР проводили при соотношении количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им праймеров с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце, составляющем 3:1.

При этом концентрация Taq-полимеразы, используемая в мультиплексной ПЦР, не превышала ее концентрации, требуемой для проведения униплексной ПЦР с аналогичными парами праймеров, и составила 0,5 е.а. в реакционной смеси.

Продолжительность (время проведения) мультиплексной ПЦР при использовании термоциклера TC-PLUS (TC-PLUS [Электронный ресурс]. - URL: http://www.techne.com/adminimages/TC_PLUS_V_1_6.pdf (дата обращения: 17.11.2011)) составила 35 минут.

В результате проведения мультиплексной ПЦР по заявляемому способу и с использованием заявляемого набора была установлена положительная ПЦР с праймерами для Chlamydia trachomatis, Mycoplasma homonis и Ureaplasma urealyticum.

Пример 3. Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки прямой кишки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genus primer и Ureaplasma urealyticum, с превалированием в микст-инфекции в качестве инфекционного агента Chlamydia trachomatis). Затем проводили мультиплексную ПЦР с первыми 7 циклами амплификации в виде трехшаговой ПЦР и с последующими 35 циклами амплификации в виде двухшаговой ПЦР с использованием набора, содержащего неблокированные прямые и обратные праймеры для Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genus primer и Ureaplasma urealyticum, гомологичные им прямые и обратные праймеры с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце:

праймеры для выявления Chlamydia trachomatis:

прямой неблокированный -

CTF 5'-GCA AGA TAT CGA GTA TGC GTT GTT AGG-3',

обратный неблокированный -

CTR 5'-TTC ATT GTA CTC ATT AAA CGA GGC GG-3',

прямой, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

CTFb 5'-GCA AGA TAT CGA GTA TGC GTT GTT AGddG,

обратный, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

CTRb 5'-TTC ATT GTA CTC ATT AAA CGA GGC GddG;

праймеры для выявления Mycoplasma genus primer:

прямой неблокированный -

MM1 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT A-3',

обратный неблокированный -

MM2 5'-TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC-3',

прямой, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

MM1b 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT ddA,

обратный, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

MM2b 5'-TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTddC;

праймеры для выявления Ureaplasma urealyticum:

прямой неблокированный -

U5 5'-CAA TCT GCT CGT GAA GTA TTA C-3',

обратный неблокированный -

U4 5'-ACG ACG TCC ATA AGC AAC T-3',

прямой, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

U5b 5'-CAA TCT GCT CGT GAA GTA TTA ddC,

обратный, модифицированный дидезоксинуклеотидом -

U4b 5'-ACG ACG TCC ATA AGC AAC ddT.

Набор также содержал термостабильный фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), положительные контроли, отрицательные контроли, воск, масло для проведения ПЦР и буфер для постановки реакции, содержащий катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с рН 7,0÷7,5 при 40÷85°С, включающей смесь глутамата калия и глутамата натрия в качестве соли глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту. Мультиплексную ПЦР проводили при соотношении количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им праймеров с дидезоксинуклеотидом на 3'-конце, составляющем 3:1.

При этом концентрация Taq-полимеразы, используемая в мультиплексной ПЦР, не превышала ее концентрации, требуемой для проведения униплексной ПЦР с аналогичными парами праймеров, и составила 2,5 е.а. в реакционной смеси.

Продолжительность (время проведения) мультиплексной ПЦР при использовании термоциклера TC-PLUS (TC-PLUS [Электронный ресурс]. - URL: http://www.techne.com/adminimages/TC_PLUS_V_1_6.pdf (дата обращения: 17.11.2011)) составила 45 минут.

В результате проведения мультиплексной ПЦР по заявляемому способу и с использованием заявляемого набора была установлена положительная ПЦР с праймерами для Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genus primer и Ureaplasma urealyticum.

Таким образом в примерах показаны преимущества заявляемого технического решения по сравнению с прототипом, заключающиеся в повышении скорости мультиплексной ПЦР без повышения концентрации ДНК-полимеразы, при предотвращении получения ложных (ложноотрицательных) результатов, связанных с различиями концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней, при использовании заявляемого способа и заявляемого набора, что в совокупности упростит ПЦР-исследования и повысит их качество.