АНТИГЕЛЬМИНТНАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ СОЛИ ЧЕТВЕРТИЧНОГО ФОСФОНИЯ И ЗАМЕЩЕННОГО ДИНИТРОБЕНЗОФУРОКСАНА

Изобретение относится преимущественно к ветеринарии, а именно к антигельминтным композиционным средствам, может быть использовано в качестве антигельминтного препарата в медицине.

Гельминтозы (аскаридоз, эзофагостомоз, анкилостомоз, токсокароз, трихоцефалез, энтеробиоз и др.) являются одними из основных паразитарных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных, а также птиц, наносят существенный ущерб экономике и представляют опасность для человека.

Клинические проявления при всех гельминтозах варьируют в широких пределах в зависимости от массивности инвазии и наличия полиинвазии. Симптомы болезни животных при различных гельминтозах в основном сходны. Возникают боли в эпигастрии, реже в подвздошной области, сопровождающиеся ухудшением аппетита, тошнотой, реже рвотой, слюноотделением, дисфункцией кишечника, аллергией, общей слабостью и похуданием животного. Тяжелые формы преимущественно регистрируются на фоне иммунодефицитных состояний и полиинвазий. Часто нематодозы сопровождаются присоединением бактериальной и грибковой инфекции. При миграции личинок (токсокароз, аскаридоз, анкилостомидоз, стронгилоидоз и др.) развивается легочная форма заболевания с кашлем, одышкой, иногда с эозинофильными инфильтратами. Кишечная форма может сочетаться с легочной. При тяжелом течении, например при стронгилоидозе, возможна перфорация кишечника с развитием перитонита.

Разработка лекарственных средств для профилактики и лечения гельминтозов, воздействующих на различные звенья патологического процесса, является актуальной задачей фармации.

Известные антигельминтные синтетические препараты по химической структуре делятся на производные этаноламина, бензимидазола, салициламида, солей пиперазина [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна. Т 2. - 2004; Червяков Д.К. и др. Лекарственные средства в ветеринарии. - М. Колос, 1977; Пат. РФ 2242976, опубл. 27.12.2004; Пат. РФ 2211835, опубл. 10.09.2003]. Предлагаются также карбонилоксицианометильные производные [Пат. РФ 2296747, опубл. 27.10.2005], производные милбемицина [Пат. РФ 2226531, опубл. 10.04.2004; Заявка РФ 2004115744, опубл. 10.04.2005], производные тетрагидрофуроизоксазола [Пат. РФ 1586154, опубл. 20.12.2006] в качестве антипаразитарных средств. Известны композиционные антигельминтные средства, включающие фенбендазол, сульфадимезин, серу и цеолит [Пат. РФ 2302864, опубл. 20.07.2007], клозантел, новокаин, поливинилпирролидон [Пат. РФ 2278661, опубл. 16.02.2004], альбендазол, медный купорос и ацетилцеллюлозу [Пат. РФ 2195280, опубл. 27.12.2002]. Недостатками известных препаратов являются:

- высокие лечебные дозы;

- побочное нейротоксическое действие;

- низкая эффективность применения по назначению;

Задачей заявленного технического решения является создание эффективного нетоксичного антигельминтного препарата нового поколения, преимущественно для ветеринарии, обладающего характерным комплексом свойств:

- низкими лечебными дозами;

- высоким значением ЛД₅₀ 3500 мг/кг;

- высокой эффективностью в отношении гельминтов, обеспечивающей расширение арсенала известных средств указанного назначения;

Техническим результатом заявленного технического решения является создание новой нетоксичной (ЛД₅₀ 3500 мг/кг) композиции, обладающей высокой антигельминтной активностью при низких (0,047-0,044 г/кг) лечебных дозах.

Заявленный технический результат достигается применением композиции, содержащей н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид и 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-нитробензофуроксан в качестве активных компонентов и глюкозу как вспомогательное вещество при весовом соотношении активных компонентов 1:10.

Как нами показано, производные бензофуроксанов обладают широким спектром биологической активности, например акарицидной и бактерицидной [Пат. РФ 2255935, опубл. 10.07.2005], а также фунгицидной [Пат. РФ 2032678, опубл. 10.04.1995]. Например, предложено их использование для лечения стенокардии [Заявка РФ 2000132204, опубл. 10.11.2002; Заявка РФ 2000132206, опубл. 20.10.2002]. Из исследованного уровня техники не выявлены сведения о наличии антигельминтной активности как у бензофуроксанов, так и у солей четвертичного фосфония, как по отдельности, так и в совокупности, что является доказательством соответствия заявленного технического решения критерию «новизна», предъявляемого к изобретениям. При этом, широко известны антибактериальные, противогрибковые и антимикробные свойства приведенных выше препаратов [Галкина И.В., Тудрий Е.В., Бахтиярова Ю.В., Егорова С.Н., Галкин В.И. Синтез, строение и исследование биологической активности солей фосфония. /В сб.: Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ. - Казань, 2008. - С.23; Pat.JP 2002308713, publ. 23.10.2002; Pat.JP 2005060332, publ. 10.03.2005; Pat.JP 2000316701, publ. 21.11.2003]. Активные компоненты заявляемой композиции на основе соли четвертичного фосфония и замещенного динитробензофуроксана, используются в заявленном техническом решении по новому для них назначению - в качестве антигельминтных препаратов, что не является очевидным для специалиста в анализируемой области техники, таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень» предъявляемому к изобретениям.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленная композиция может быть получена посредством использования известных компонентов с применением стандартного оборудования и извесных приемов.

Сущность заявленного технического решения заключается в создании антигельминтной композиции, содержащей н-гексадецилтрифенилфос фоний бромид и 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-нитробензофуроксан в качестве активных компонентов при их весовом соотношении 1: 10 и глюкозу как вспомогательное вещество.

Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом:

1. Получают первый компонент заявляемой композиции - н-гексадецилтрифенил фосфоний бромид формулы I

синтезировали способом (здесь и далее признаки способа?), описанным в [Старке Ч.М. Межфазный катализ. Химия, катализаторы и применение / Ред. Ч.М.Старкс. М.: Химия, 1991. - 157 с.]:

2. Получают второй компонент - 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксан формулы II синтезировали по методике [Л.М.Юсупова, С.Ю.Гармонов, И.М.Захаров и др. Средства биологической защиты многоцелевого назначения на основе хлорпроизводных нитробензо-фуроксана. /Вестник Казанского технологического университета, 2005 г., №1, с.103-111]:

Глюкозу кристаллическую медицинскую использовали по ГОСТ 975-88 в качестве питательного вещества для гельминтов и наполнителя (производитель Днепропетровский крахмально-паточный комбинат).

Заявленное техническое решение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Проводят синтез н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида.

К избытку 6.1 г (0.02 моль) раствора гексадецилбромида прибавляют 2.62 г (0.01 моль) трифенилфосфина. Реакционную смесь нагревают в течение 15 часов при температуре 120°С. Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают этиловым эфиром от исходных соединений. Выход 87%. Т.пл. 103.4°С, Т. разл. 320.9°С, δ_р ³¹=25.8 м.д.

Элементный анализ С₃₄Н₄₈Вr,Р. Найдено, %: С 71.96; Н 8.47; Р 5.83. Вычислено, %: С 71.54; Н 8.53; Р 5.47.

Пример 2. Проводят синтез 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксана.

К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксану в 10 мл этилового спирта прибавляют по каплям 2.76 г (0.02 моль) м-нитроанилина в 15 мл этилового спирта. Через 30 минут после охлаждения реакционной смеси кристаллическую массу ярко-красного цвета отделяют и перекристаллизовывают из смеси хлороформ-гексан. Выход 78%. Т пл. 226°С.

Элементный анализ C₁₈H₁₀N₈O₁₀. Найдено, %: С 43.71; Н 1.97; N 22.34. Вычислено, %: С 43.37; Н 2.01; N 22.51.

Пример 3. Получение антигельминтной композиции и лекарственного препарата на его основе.

В фарфоровой ступке смешивают и растирают 2,25 г глюкозы, 0,25 г н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида (далее соль фосфония или СФ) и 2,50 г 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксана (далее динитробензофуроксан или ДНБФ) до получения однородного порошка красного цвета, которым наполняют 10 облаток (дозированные закрывающиеся контейнеры из крахмала). Пероральная лекарственная форма весом 0.5 г содержит 0,025 г соли фосфония, 0.250 г динитробензофуроксана и 0.225 г глюкозы.

Пример 4. Изучение ангигельминтной активности в отношении смешанного гильментоза свиней, вызванного: аскаридой Ascaris suum, эзофагостомой Ое-sophagostomum dentatum и власоглавом Trichocephalus suis.

Антигельминтная активность заявляемого состава композиции исследована на поросятах (свинках) в ООО «Колос» Тетюшского района Татарстана, а также в условиях вивария кафедры паразитологии и радиобиологии ГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины». У каждого спонтанно инвазированного нематодами животного индивидуально брали пробы фекалий, которые исследовали на наличие яиц гельминтов по методу Фюллеборна. На основании результатов гельминтоовоскопического исследования были отобраны 6 поросят 3-4 месячного возраста (средний вес от 23 до 25 кг) и разделены на 3 группы по 2 поросенка в каждой: в 1-й группе применяли композицию, во 2-й группе - соль фосфония, в 3-й группе - динитробензофуроксан.

При исследовании антигельминтной активности композиции и ее компонентов препарат вводили животным перорально в облатках с кормами 2 раза в день - утром и вечером. Лекарственный препарат для 1-й группы поросят описан в примере 3. Для 2-й группы лекарственная форма весом 0.5 г содержала 0,025 г соли фосфония и 0.475 г глюкозы. Для 3-й группы лекарственная форма весом 0.5 г содержала 0.250 г динитробензофуроксана и 0.250 г глюкозы.

Характеристические данные испытуемых поросят до лечения и дозы лекарственных препаратов на курс дегельминтизации представлены в таблице 1. Как следует из данных таблицы 1, во всех группах картина крови характеризовалась анемией, лейкоцитопенией, эритроцитопенией.

Фекалии поросят исследовали через 1, 2, 3 и 4 недели после применения испытуемых препаратов. Результаты копрологических исследований и оценка состояния животных приведены в таблице 2.

Как следует из данных, представленных в таблице 2, полная дегельминтизация поросят произошла лишь только в первой группе, принимавшей композицию.

В 1 группе поросят, получавших композицию, процесс дегельминтизации прошел в течение 1-2 дней с дальнейшим двух недельным постепенным очищением организма от остатков гельминтов и мертвых яиц. Показатели крови нормализовались через 2 недели. Появлявшийся временно в течение первой недели кашель свидетельствовал о гибели личинок нематод в легких, а аллергические реакции были связаны с одновременной гибелью большого количества нематод. Кашель и аллергия были выражены незначительно и прошли самопроизвольно. Фекалии осветленного цвета пластилиновой консистенции появились однократно на - десятый день у 1-й свинки (микроскопия выявила остатки кутикулы аскарид) и дважды у 2-й свинки на 7-й и 10-й день в виде остатков кутикул эзофагостом и аскарид соответственно. По сравнению с поросятами 2 и 3 групп, в группе 1 животные после дегельминтизации были наиболее активны, поноса и каких-либо других побочных эффектов приема препаратов не наблюдалось. Необходимо отметить улучшение общего состояния животных и хороший аппетит после приема фармацевтической композиции. Заключение патологоанатома: в кишечнике гельминты не обнаружены.

Во 2 группе, получавшей соль фосфония, картина дегельминтизации оказалась более размытой и очищение организма хозяина более плавным. Показатели крови нормализовались в течение 3-х недель. У 4-й свинки произошел затяжной процесс очищения, который ставит под сомнение полную дегельминтизацию. Таким образом, несмотря на разрушение кутикулы нематод под действием соли фосфония, прием соли без динитробензофуроксана оказался менее эффективным, чем их сочетание в композиции (группа 1).

В 3 группе поросят, получавших динитробензофуроксан, наряду с дегельминтизацией (выход мертвых неполовозрелых аскарид, от 8 до 15 см) через 4 недели количество яиц паразитов не изменялось, а в дальнейшем у шестой свинки появилась тенденция к их росту на фоне присоединившейся кишечной инфекции, что проявлялось диареей, исхуданием животного и сопровождалось лейкоцитозом крови. Таким образом, несмотря на наличие антигельминтной активности у динитробензофуроксана, применение его менее эффективно по сравнению с композицией, содержащей динитробензофуроксан и соль фосфония, т.к. во-первых, кутикула нематод не разрушается и, во-вторых, присоединяется кишечная инфекция.

Появление большого количества яиц разного срока созревания в 1 и 2 группе поросят объясняется нарушением целостности кутикулы гельминтов, а также матки и яйцеводов, что делает тело гельминта доступным для пищеварительных соков кишечника хозяина. Результаты выращивания личинок из полученных таким образом яиц нематод однозначно показали на полное отсутствие развития последних.

В результате проведенного исследования установлено, что заявляемая композиция обладает высоким антигильминтозным действием при низких лечебных дозах 0,047-0,044 г/кг, в то время как препараты пиперазинового ряда используются в дозах 0.33 г/кг (в 8 раз превышают дозу предлагаемого препарата). При этом не наблюдается расстройств стула и других признаков кишечной инфекции.

Уровень острой токсичности заявляемой антигельминтной композиции ЛД₅₀ 3500 мг/кг на мышах в условиях внутрибрюшинного и перорального способов введения соответствует категории «относительно безвредные» - VI класс токсичности по Измерову [Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном введении (Справочник). - М.: Медицина, 1977. - С. 196-197].

Таким образом, композиция, включающая три компонента - н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид, 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксан в определенном весовом соотношении и глюкозу, обладает высокой эффективностью при дегельминтизации зараженных животных в низких лечебных дозах. Каждый компонент данной композиции вносит свой вклад в антигельминтное действие препарата:

- соль фосфония - проникающий через мембраны кутикулы компонент, приводящий к гибели гельминтов и патогенной микрофлоры за счет доступности пищеварительных соков хозяина внутрь паразита (что подтверждается разрушением кутикулы нематод, пластилинообразным состоянием фекалий и отсутствием нематод в фекалиях животных 1 и 2 группы);

- замещенный нитробензофуроксан - компонент, генерирующий NO in vivo и вызывающий спастические судороги нематод, в итоге парализующий мышечную ткань нематод (что подтверждается выходом мертвых аскарид в 3 группе);

- глюкоза - основное питательное вещество гельминтов, в данном случае является необходимой «приманкой» для паразита в кишечнике хозяина.