Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДДЕРЖАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЦИРРОТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННОЙ ПЕЧЕНИ У ПАЦИЕНТОВ В ЛИСТЕ ОЖИДАНИЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ОРГАНА

Изобретение относится к медицине и биологии и может найти применение в трансплантологии для немедикаментозной поддержки больных с терминальными стадиями болезней печени.

Поскольку основной проблемой в трансплантологии является сохраняющийся дефицит донорских органов, срок ожидания трансплантации увеличивается при возрастании числа нуждающихся, при этом в период ожидания функция печени неизбежно ухудшается, риск летального исхода возрастает с течением времени. Для пациентов в листе ожидания поддерживающая терапия постепенно становится мало эффективной, задача сохранения функционального состояния печени до операции является чрезвычайно актуальной. На практике подбор трансплантата занимает неопределенное время, как правило, длительное, в течение которого функция печени больного продолжает неизбежно снижаться, увеличивая риск летального исхода. Большое количество таких больных, явный недостаток донорских органов и отсутствие специализированных методов эффективной медикаментозной поддержки функции печени у пациентов в листе ожидания выдвигают задачу активного медицинского поддержания остаточной функции цирротически измененной печени в течение всего периода ожидания трансплантации.

Исследования последних лет определили современную стратегию поиска решения проблемы в сфере регенеративной клеточной терапии, основанной на недавно обнаруженном свойстве стволовых гемопоэтических клеток (ГСК) способствовать регенерации тканей другого гистотипа.

С 2005 года и по настоящее время предпринимаются попытки мобилизации выхода аутологичных ГСК из костного мозга (КМ) в кровь пациента путем стимуляции кроветворения инъекциями ростовых факторов [ClinProc. 2014 Mar; 89 (3): 414-424. doi:10.1016/j.mayocp.2013.10.023; CellTransplant. 2010; 19 (1l): 1475-86; BMJOpen. 2015 Mar 20; 5 (3): е007700],либо путемпредварительного изъятия части костного мозга и последующей реинфузииего в кровь в виде очищенной фракции ГСК с фенотипами CD133+ [STEMCELLSVolume 23, Issue 4 April 2005Pages 463-470], либо CD34+ГСК [StemCells. 2006 Jul; 24 (7): 1822-1830; J.Gastroenteroi 2007 Jun 28; 13 (24): 3359-3363; Am J Gastroenterol. 2008 Aug; 103 (8): 1952-1958; Cell Prolif. 2008 Feb; 41 Suppl 1 (): 115-25], либо в виде общей лимфоцитарно-моноцитарной взвеси клеток КМ, называемой мононуклеарной фракцией (МНФ) [EuropeanJournalof Gastroenterology & Hepatology 2010, 22: 33-42]. Длительный период этих попыток до сих пор не привел к окончательному заключению о преимуществе какого-либо из перечисленных подходов, выявил небезопасность внутрисосудистых инфузий клеточного материала при декомпенсированном циррозе в виде таких осложнений как нефропатия и гепаторенальный синдром [J. Gastroenterol. 2007 Jun 28; 13 (24): 3359-3363], но большинство авторов подтверждают необходимость дальнейших поисков использования терапевтических возможностей ГСК при циррозе печени.

Наиболее близким к предлагаемому является способ активного поддержания функции цирротической печени, описанный в работе [StemCellsTranslMed. 2016 Jan; 5 (1): 87-94. doi: 10.5966/sctm.2015-0004 PMCID: PMC4704869.].

Этот способ основан на предположении о том, что CD133+ГСК костного мозга оказывают стимулирующее регенерацию печеночных клеток действие подобно аналогичным феноменам, регистрируемым с ГСК в других тканях и органах.

Способ осуществляется путем предварительной трепанобиопсии из крыла собственной подвздошной кости пациента и аспирации 150 мл КМ, последующей изоляции из него в условиях лаборатории фракции мононуклеарных клеток (МНК) и/или фракции CD133+ГСК, и реинфузии полученных МНК или CD133+ГСК в 20 мл изотонического раствора в портальную вену пациентов под местной анестезией через катетер в течение 5-10 минут на заключительной фазе процедуры. Как отмечено авторами, анализ введения МНК восьми пациентам и трем - CD133+ГСК, не выявил отличий в основном интегральном показателе неотложности выполнения трансплантации печени (MELD) в сравнении с плацебо. Вместе с тем было отмечено временное преимущество CD133+ГСК по сравнению с МНК и плацебо, хотя и статистически недостоверное (р=0.08). Тем не менее авторы пришли к заключению о перспективности дальнейшего изучения именно CD133+ГСК.

Достоинством способа-прототипа является использование CD133+ГСК, менее изученных, но более перспективных по сравнению с МНК.

Однако способу присущ целый ряд недостатков:

- с учетом критического состояния здоровья реципиентов, ожидающих трансплантацию, выполнение инвазивной процедуры оперативного изъятия части костного мозга нежелательно ввиду травматичности и связанных с этим рисков кровотечения и инфекции;

- длительное пребывание больного в режиме ожидания может потребовать повторных инвазивных пункций КМ и его реинфузии, что еще более усугубляет отмеченные недостатки и негативно влияет на кроветворную функцию КМ;

Кроме того, способ неспецифичен, т.к. среди клеток CD 133+ГСК далеко не все специфичны к печени. У здоровых людей концентрация специфичных (коммитированных) клеток с маркерным белком печени альфа-фетопротеин (афп+CD133+ГСК) исчисляется сотыми долями процента в лимфоцитах крови, а при циррозе печени их еще меньше [Russian journal of transplantology and artificialorgans). 2015, 17 (1): 68-73; Jacobs Journal of Regenerative Medicine, 2016, 1 (3): pp. 1-9].

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении специфичности поддержания функционального состояния цирротически измененной печени у пациентов в листе ожидания трансплантации органа за счет неинвазивной механической вибрации, индуцирующей опосредованное высвобождение в кровь афп+CD133+ГСК, коммитированных к печени, и снижающей травматичность способа.

Этот результат достигается тем, что в известном способе, включающем доставку в печень аутологичных CD133+ ГСК, согласно изобретению, доставку CD133+ГСК осуществляют путем чрескожной неинвазивной механической вибрации на область печени в диапазоне 0.02-10 кГц, индуцирующей опосредованное высвобождение в кровь афп+CD133+ГСК, мониторируют их содержание в лимфоцитах крови не реже одного раза в неделю методом проточной цитометрии до и во время курса вибрации по показателям абсолютного содержания афп+ CD133+ ГСК и относительного их содержания в общей фракции CD133+ГСК, при этом вибрацию осуществляют ежедневно один раз в день в течение 15 минут при амплитуде вибраций 10±2 мкм и длительности каждого цикла 60+10 сек., по достижению максимального увеличения хотя бы одного из этих показателей во время курса вибрации по сравнению с их значениями до него вибрационное воздействие заканчивают, продолжая мониторирование, и в случае снижения достигнутых показателей вибрационное воздействие повторяют в тех же режимах.

К созданию предлагаемого способа нас побудило то, что для поддержания функционального состояния цирротически измененной печени прототип и другие известные способы, как выше сказано, оказываются не только травматичными для пациентов, но и неспецифичными.

Наряду с известными многочисленными доказательствами положительного влияния циркулирующих в крови субпопуляций ГСК на регенерацию и функцию различных органов в последние годы доказано существование в общих фракциях ГСК специальных субфракций, несущих специфический для целевого органа белок, который указывает на коммитированность (специфичность) данной субфракции к этому органу - в предлагаемом способе это печень [Biol Cell. 2005, 97 (2): 133-146; USA SuttonHartPress; 2010; Shoutko AN et ah, Jacobs Journal of Regenerative Medicine, 2016, 1 (3): pp. 1-9]. Мишенями циркулирующих коммитированных афп+CD133+ГСК являются гепатобласты (гепатоциты в фазе S клеточного цикла) печени, обеспечивающие регенерацию органа и имеющие идентичные маркеры афп и CD133. Как нами показано ранее, пересадка новой печени индуцирует увеличение афп+CD133+ГСК в крови реципиента [Shoutko, A.N. etal,. Gene and Cell Therapy, 2, 7-15]. Таким образом мы пришли к заключению, что все известные подходы, включая прототип, не учитывали важной роли афп+CD133+ГСК субфракциии. Поскольку основная масса CD133+ГСК из пунктата КМ может быть нейтральной или коммитированной к другим различным тканям организма, а не только к печени, расчет на ее высокую эффективность в поддержании функционального состояния цирротически измененной печени, не оправдан.

Других работ по этому вопросу нам не встречалось. В то же время именно доказанный нами факт наличия ГСК, специфичных к целевым тканям, стал основой для попытки использовать именно коммитированные клетки с целью создания нового неинвазивного подхода к поддержанию функционального состояния печени у пациентов в листе ожидания трансплантации органа.

Поскольку все описанные нами известные способы внутрисосудистого введения аутологичных ГСК, извлекаемых предварительно непосредственно из КМ пациента (прототип), оказались неспецифичными и потенциально опасными, мы попытались разработать более специфичный и неинвазивной способ решения данной проблемы путем дистанционной активации вывода из КМ в кровь пациента коммитированных к печени ГСК.

Занимаясь профессионально в течение многих лет вибрационными воздействиями с целью активации вывода ГСК из КМ [Патенты №2268031, №2166924], мы решили попробовать использовать эту идею для поддержания функционального состояния цирротически измененной печени.

Осуществление доставки ГСК путем неинвазивной механической вибрации печени в диапазоне 0.02-10 кГц индуцирует, что нами доказано, создание в КМ и выведение в кровь ГСК, коммитированных непосредственно к клеткам паренхимы печени. Использование неинвазивной механической вибрации печени исключает необходимость инвазивного извлечения КМ из плоских костей пациента, выделения общей фракции ГСК и последующей внутрисосудистой реинфузии этой фракции ГСК, неспецифичной для печени.

Режимы вибрационного воздействия на область печени и расположение источников вибрации - виброфонов - в специальном поясе для пациентов, удобном для закрепления его на теле в области печени, найдены нами опытным путем.

Использование цитометрического метода обеспечивает быстрое и точное определение в лимфоцитах крови абсолютного содержания коммитированных афп⁺CD133⁺ ГСК и относительного содержания их в общей фракции CD133+ГСК. Эти показатели характеризуют степень обогащения крови специфическими для печени клетками, позволяя в любой момент оценивать физиологическую связь органа с системой кроветворения. Осуществление такого опосредованного способа выведения в кровь коммитированных к клеткам паренхимы печени ГСК, как нами показано при использовании его у пациентов, находящихся в листе ожидания трансплантации органа, является, на наш взгляд, перспективным для решения поставленной нами задачи и составило предмет настоящего изобретения.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Пациентка Б., 55 лет(1962 г.р.), обратилась 17.11.2016 г. в РНЦРХТ с диагнозом: Неверифицированный цирроз печени (МКБ-К74.6) для обследования и определения показаний к трансплантации печени.

Из анамнеза заболевания: Считает себя больной с мая 2015 г., когда впервые начала отмечать желтушность склер и кожных покровов. Обследовалась по месту жительства, на основании данных клинического и инструментального обследования установлен цирроз печени, осложненный портальной гипертензией (асцит, варикозно-расширенные вены пищевода 2 ст). В мае 2016 г. была направлена на консультацию в РНЦРХТ с целью определения показаний к трансплантации печени.

При поступлении в Центр 17.11.2016 г.противопоказаний к трансплантации печени не выявлено. Пациентка согласилась на оперативное лечение и была включена в лист ожидания. Поскольку в листе ожидания Центра находилось в это время около 140 человек, а период ожидания в среднем составлял более 8 месяцев, больной в ходе планового визита было предложено для использования в амбулаторном режиме вибрационное воздействие на область печени. После получения информированного согласия больная прошла лабораторное исследование крови: клинический, биохимический анализ крови, коагулограмма, онкомаркеры. Выполнена спиральная компьютерная томография (СКТ) грудной клетки, живота, таза с контрастным усилением, исключена онкопатология. Произведена ультразвуковая эластометрия печени, при оценке плотности в 3 сегментах печени: SIII, SV, SVI получены значения 28 кРа, 23 кРа, 21 кРа соответственно, что соответствует степени фиброз 4 (F4). Оценка по шкалам Child-Puhg 9 баллов, что соответствует классу цирроза печени В, MELD-Na 15 баллов.

Перед вибрационным воздействием у больной в лимфоцитах крови цитометрически определили содержание афп+CD133+ГСК и CD133+ГСК (Табл. 1).

12.12.2016 г. начали вибрационное воздействие один раз в день в течение 15 минут при амплитуде вибраций 10±2 мкм и длительности каждого цикла 60±10 сек. Такое воздействие на область печени проводили с помощью терапевтического блока (ТБ), подключенного к серийному сертифицированному источнику электромеханических колебаний - аппарату виброакустического воздействия «ВИТАФОН-5», Гост50444-92 и ТУ9444-009-23138557-2009. ТБ для контактной чрескожной передачи механических микровибраций к тканям печени изготовлен в ООО «ВИТАФОН» и состоит из 8-ми виброфонов диаметром 45 мм стандартного комплекта аппарата «ВИТАФОН-5», которые расположены в ТБ в два ряда (по четыре в каждом). Расстояния между центрами рядов 75 мм и центрами виброфонов внутри каждого ряда 55 мм. Таким образом образуется активное прямоугольное поле размером 12×22 см, объединенное плоским матерчатым каркасом с 8 фиксирующими гнездами и регулируемыми мягкими креплениями для фиксации на теле человека. Такой ТБ размещается на правом боку пациента таким образом, чтобы блок виброфонов плотно покрывал проекцию области печени, а нижний край его совпадал с нижней границей ребер.

Процедуру больная перенесла удовлетворительно, осложнений не наблюдалось. Вибрационные воздействия продолжали ежедневно по 1 разу в день в тех же режимах с одновременным мониторированием ГСК не реже одного раза в неделю вплоть до 19.12.2016 г., когда показатели ГСК достигли максимума. Эти данные приведены в Таблице 1 в виде процентного содержания коммитированных афп+CD133+ГСК в лимфоцитах (строка 1) и общих CD133+ГСК (строка 2), а также процентного содержания коммитированных афп+CD133+ ГСК в общих CD133+ ГСК (строка 3).

Как видно из таблицы, положительный ответ получили 19.12.2016 г. (через неделю) в виде увеличения абсолютного содержания

афп+CD133+коммитированных ГСК в 1,7 раза и относительного их содержания во фракции CD133+ГСК - в 1,9 раза.

Вибрационное воздействие было прекращено, а мониторирование продолжено. К 02.02.2016 г.показатели существенно снизились (см. Табл. 1), поэтому вибрационное воздействие возобновили в тех же режимах. К 20.02.2017 г. (через 3 недели) было получено существенное - 5-кратное увеличение афп+CD133+коммитированных СГК и 2-кратное увеличение их в общей фракции CD133+ГСК, после чего воздействие вновь прервали.

26.04.2017 г.после очередного снижения показателей вибрационное воздействие было начато снова. Через 5 недель воздействия (вплоть до 29.05.2017 г.) было достигнуто почти 3-х кратное увеличение коммитированных афп+ГСК и 2-х кратное увеличение их в общей фракции CD133+ГСК.

В связи с отсутствием больной (с 29.05.2017 г.по 17.01.2018 г) наблюдение за нею было прервано.

18.01.2018 г.было обнаружено существенное снижение показателей - до 0,0009 и 3,4 соответственно. Вибрационное воздействие возобновили и в течение 2-х недель показатели были увеличены в 2,8 раза для афп+CD133+коммитированных ГСК и в 2,1 раза для их содержания в общей фракции CD133+ГСК.

За время наблюдения за больной состояние оставалось удовлетворительным, ухудшения функции печени не было получено, по окончании воздействия в мае 2017 г. (29.05.17) показатель Child-Pugh 6 баллов, что соответствует классу тяжести цирроза A, a MELD - 12 баллов. Таким образом, прогностические показатели существенно улучшились. В период отсутствия вибрационного воздействия при продолжении амбулаторного лечения по месту жительства субъективного ухудшения самочувствия больная не отметила, однако, выявлены изменения в виде увеличения концентрации билирубина в крови, MELD 15 баллов, по шкале Child-Pugh 7 баллов, что соответствует тяжести цирроза класс В, то есть вновь фиксировалось состояние, как при обращении, но после каждого выполнения ей вибрационного воздействия, прогностические показатели существенно улучшались.

Исходные значения показателей подчеркнуты.

ВЫВОД: Благодаря вибрационным воздействиям у больной более года удавалось поддерживать функциональное состояние печени без прогрессирования цирроза.

Пример 2.

Больной Я., 54 года (1963 г.р.), обратился в РНЦРХТ 14.09.2016 г.

по рекомендации врача-гастроэнтеролога, с диагнозом: Первичный билиарный цирроз (ПБЦ) печени (МКБ-К74.3) для обследования и определения показаний к трансплантации печени.

Из анамнеза заболевания: Считает себя больным с 2014 г., когда впервые начал отмечать желтушность склер и кожных покровов. Обследован в клинике СЗГМУ им. Мечникова, установлен диагноз ПБЦ на основании лабораторных исследований (высокие билирубин, АЛТ, ACT, щелочная фосфатаза) и иммунологических тестов (антимитохондриальные антитела). Назначены препараты урсодезоксихолевой кислоты (УДХК). В динамике на фоне лечения УДХК без улучшения, после чего назначен преднизолон в суточной дозе 60 мг, что позволило достичь биохимической ремиссии, но сохранялись гепатоспленомегалия, расширение внутрипеченочных желчных протоков. В сентябре 2017 г.был направлен на консультацию в РНЦРХТ с целью определения показаний к трансплантации печени.

В результате обследования в клинике по протоколу отбора на трансплантацию противопоказаний не выявлено. Пациент согласился на оперативное лечение и был включен в лист ожидания. Учитывая длительные сроки ожидания, больному в ходе планового визита предложено для использования в амбулаторном режиме вибрационное воздействие на область печени с целью стимуляции выделения в кровь из КМ коммитированных к ткани печени стволовых гемопоэтческих клеток.

При обследовании перед началом вибрационного воздействия установлены значения основных прогностических показателей: MELD 18 баллов, Child-Pugh 8 баллов, что определяло класс тяжести цирроза печени как В. Далее процедуры подготовки больного и вибрационного воздействия выполнялись аналогично Примеру 1. Осложнений при проведении процедур не было. Результаты цитометрического мониторирования представлены в Таблице 2.

Исходные значения показателей подчеркнуты.

За относительно небольшое время наблюдения показатели функции печени не изменились, а уровень билирубина снизился с 80 до 62 мкмоль/л. MELD снизился с 18 до 16 баллов. Таким образом, ухудшения состояния больного нет, вибрационное воздействие может быть продолжено.

Еженедельное мониторирование показателей функции печени показали, что максимальное увеличение абсолютного содержания афп+CD133+коммитированных клеток в лимфоцитах (с 0,0011 до 0,032) и их относительного содержания во фракции CD133+ СГК (с 1,96 до 25,1) произошло через 4 недели.

Выводы: Благодаря вибрационным воздействиям у больного получено 3-кратное увеличение коммитированных к печени клеток в лимфоцитах и более чем 12-кратное увеличение их содержание в общей фракции ГСК. Пациент продолжает наблюдаться.

К настоящему времени предлагаемый способ использован у 7 пациентов, у всех из них удается поддерживать функциональное состояние печени без прогрессирования цирроза.

Предлагаемый способ по сравнению с известными имеет ряд существенных преимуществ, основными из которых являются специфичность по отношению к целевому органу, неинвазивность - исключение хирургической травмы -, а также возможность неоднократных повторений без причинения ущерба здоровью больного с терминальной стадией болезни печени.

Способ разработан в группе трансплантологии совместно с лабораторией методов повышения эффективности терапии РНЦРХТ и ООО «ВИТАФОН» и прошел клиническую апробацию у 7 потенциальных реципиентов с положительным результатом.