СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к области химической технологии и может быть использовано при производстве гиалуроновой кислоты для медицинских целей.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты путем обескровливания петушиных гребней, измельчения их, экстракции водой, термообработки экстракта при 90-100^oC, охлаждения экстракционной массы до 4-6^oC, отделения липидов, фильтрации массы, очистки фильтрата и выделения препарата путем введения активированного угля, перемешивания массы и фильтрования ее, а затем смешиванием полученного фильтрата с осадком сырья и двухстадийной экстракцией его водой в присутствии пенициллина с последующей сушкой экстракта /авт. св. СССР N1616926, C 08 B 37/08, БИ N 48, 1990 /.

Способ отличается сложностью при его реализации на производстве. Применение пенициллина может вызвать аллергическую реакцию организма на препарат. Выделение препарата путем введения активированного угля влечет за собой большие потери продукта, что весьма нетехнологично.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты, согласно которому сырье - гребни петухов и кур обескровливают, измельчают, многократно отмывают этанолом, содержащим хлороформ, дважды экстрагируют водой, объединенные экстракты подвергают депротеинизации путем многократной обработкой хлороформом, целевой продукт осаждают этанолом, обрабатывают ацетоном и сушат /Layton G. T., Stanwerth D.R. J. Immuol. Methods, 1984,42, p.329/.

Полученный известным способом продукт используется преимущественно в офтальмологии, так как он содержит до 0,5% белковых веществ, однако использование ацетона при его производстве, помимо сохранения его неприятного запаха, может привести к неприятным последствиям в случае, когда в продукте (имеется в виду случайно) могут оказаться остатки опасной жидкости.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты, включающий обескровливание и получение сырья - гребней петухов и кур, многократную промывку измельченного сырья этанолом и хлороформом, экстракцию промытого и измельченного сырья водой, подкисленной до pH 3-4, депротеинизацию профильтрованного экстракта активированным углем, а затем диэтиламиноэтилцеллюлозой, фильтрацию последовательным пропусканием депротеинизированного экстракта через разнообразные фильтры и сушку целевого продукта / патент РФ N 2074196, C 08 B 37/08, БИ N 6,1997 /.

Полученный продукт содержит менее 0,05% белка. Однако это трудно согласуется с экстракцией сырья водой, подкисленной до pH 3-4 при 90-100^oC в течение 40-50 мин. При таких условиях в режиме экстракции протеогликановый агрегат (АПГ) - белково-гиалуроновый комплекс - коагулирует. Активированный уголь, используемый для первой стадии депротеинизации, адсорбирует на свою поверхность не только свободный белок, но и саму кислоту. При такой технологии выход продукта составляет лишь 0,09-0,12% от массы сырья, что не оправдано экономически.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты, сходный с заявленным по наибольшему количеству существенных признаков / патент РФ N 2102400, C 08 B 37/08, БИ N 2,1998 /.

Способ включает двухстадийную экстракцию измельченных петушиных гребней, объединение экстрактов, осаждение гиалуроновой кислоты уксусной кислотой, растворение осадка в воде, обработку едким натром, окончательную очистку и получение концентрированного целевого продукта лиофилизацией.

Продукт, полученный известным способом, не нормируется по содержанию в нем белка. Это обосновано в случае его наружного применения, например в дерматологии и косметике. Повышение стабильности гиалуроновой кислоты при наличии в ее составе белка в то же время снижает ее биологическую совместимость с организмом потребителя (медицинская и ветеринарная практика). При этом необходимо отметить такие положительные качества известной технологии, как относительная простота, экономичность и стабильность целевого продукта по химическому составу.

Задача, решаемая изобретением, заключается в разработке очередного способа получения гиалуроновой кислоты, который отличается относительной простотой и небольшим временем протекания технологического процесса, в результате чего появится продукт с минимальным содержанием белка, что позволит применять его в медицинских целях, например в гинекологии.

Для решения поставленной задачи в известном способе получения гиалуроновой кислоты, включающем многостадийную экстракцию измельченных петушиных гребней, объединение экстрактов, осаждение уксусной кислотой, растворение осадка в воде, обработку едким натром, окончательную очистку и получение концентрированного целевого продукта, для осаждения уксусной кислотой используют пятую и последующие вытяжки, а после обработки щелочью последовательно производят ферментный гидролиз белка, ультрафильтрацию, спиртоосаждение этанолом и последующее растворение осадка в водном растворе последнего.

Кроме этого:
- ферментный гидролиз белка ведут раствором папаина в течение 20-40 ч с восстановлением pH раствора до 6-7 через каждые 6-8 ч, а спиртоосаждение ведут 90-96% этанолом;
- окончательную очистку продукта ведут мембранной фильтрацией его раствора в 30-50% растворе этанола в воде;
- концентрированный целевой продукт получают удалением этанола из отфильтрованного раствора.

Гиалуроновую кислоту получают следующим образом. Петушиные гребни очищают от посторонних предметов, заливают холодной водой и выстаивают в течение некоторого времени с периодической сменой воды. Гребни извлекают, отжимая воду, и измельчают до получения фарша. Фарш заливают водой, доводят до кипения, экстракт отделяют. Процесс вытяжки повторяют еще три раза. Таким образом происходит удаление липидов и частично свободных белков. Полученные экстракты направляются на другие технологические нужды.

Начиная с пятой и последующих вытяжек экстракты объединяют и фильтруют для отделения твердых включений и больших белковых конгломератов.

Для осаждения АПГ отфильтрованные экстракты обрабатывают уксусной кислотой. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок растворяют в дистиллированой воде и обрабатывают раствором щелочи для получения натриевой соли гиалуроновой кислоты (ГУК).

Далее производят ферментный гидролиз присоединенного белка, входящего в состав АПГ. Гидролизованный белок отделяют ультрафильтрацией.

В концентрированном продукте производят спиртоосаждение ГУК этанолом. Одновременно осуществляется стерилизация вещества. Надосадочную жидкость удаляют.

Полученный коагулят растворяют в смеси этанола с водой, этот раствор фильтруют на мембранных фильтрах до получения совершенно прозрачного фильтрата. Такой способ фильтрации позволяет не только отфильтровывать споры бактерий, но и сохранять стерильность на протяжении всего процесса. Кроме этого, этанол способствует прохождению макромолекул ГУК через поры мембраны, что значительно увеличивает производительность (в сравнении с водным раствором ГУК).

В дальнейшем этанол выводится из раствора вакуумным выпариванием. После этой операции можно производить лиофильную сушку, так как выпаривание приводит к значительному увеличению концентрации раствора.

Реализацию способа получения гиалуроновой кислоты проиллюстрируем на следующем примере.

23 кг петушиных гребней очищают от посторонних предметов и тщательно промывают холодной водой. Полученное сырье измельчают до получения фарша вязкости 2,1. Фарш заливают водой в пропорции 1: 2,5, доводят до кипения, экстракт отделяют. Процесс вытяжки повторяют еще три раза. Экстракты первых четырех вытяжек не участвуют в дальнейшем технологическом процессе.

Начиная с пятой и последующих вытяжек экстракты объединяют и фильтруют на тканях для отделения твердой фазы.

Отфильтрованные экстракты обрабатывают уксусной кислотой при pH 5 в течение 18,5 ч. Формируется осадок. Надосадочную жидкость сливают. Осадок смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3 и обрабатывают раствором едкого натра при pH 8. Добавляют 0,1% раствор папаина в количестве 5 литров. Периодически в течение 26 ч с интервалом в 6,5 ч pH раствора восстанавливают до 7. Полученный продукт очищают ультрафильтрацией и производят его обработку 96% этанолом. Надосадочную жидкость сливают. Осадок смешивают с 40% раствором этанола в воде. Производят окончательную очистку методом мембранной фильтрации. Путем выпаривания этанола в течение 0,5 ч концентрацию продукта доводят с 1,5 до 3% ГУК. После этого производят лиофильную сушку.

Полученный препарат представляет собой натриевую соль гиалуроновой кислоты - так называемое "сухое вещество" с минимальным содержанием белка.

Как показала практика, предпочтительными для осаждения гиалуроновой кислоты уксусной кислотой являются пятая и шестая вытяжки. Объем осадка в них сопоставим с первыми четырьмя вытяжками, количество липидов - практически равно нулю, содержание белка - минимально, а количество "сухого вещества" - выгодно отличается в большую сторону.

Заявленный способ не требует значительных расходов химических реактивов, а этанол легко перегоняется и возвращается в техпроцесс. Это характеризует данный способ как экономичный и предпочтительный для использования и тиражирования.