Результат интеллектуальной деятельности: ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ НА ОСНОВЕ ВТОРИЧНОГО ПРОДУКТА ГИДРОЛИЗАТА ГОВЯЖЬЕГО МЯСА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования микроорганизмов.

Известна питательная среда для культивирования микроорганизмов, включающая, г/л: гидролизат говяжьего мяса с содержанием общего азота 250-300 мг % и аминного азота 30-130 мг % - 120,0, разведенный дистиллированной водой до 1 л, натрий хлористый - 5,0; натрия дигидрофосфат - 0,3; агар микробиологический - 24,0. Кипятят до полного растворения агар-агара. Фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Разливают во флаконы, стерилизуют 30 мин при 1 атм. (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6.-2008. С. 66-67).

Недостатком данной среды является нестабильность роста микроорганизмов.

Наиболее близкой к предполагаемому изобретению является питательная среда для культивирования микроорганизмов, включающая, г/л: гидролизат говяжьего мяса с содержанием общего азота 700-900 мг % и аминного азота 0,12-0,14% - 180,0, натрий хлористый - 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 4,0. Доводят до кипения, устанавливают рН 7,2±0,2 при помощи (20±1)% раствора натрия гидроокиси (если рН ниже заданного значения), или раствором соляной кислоты 1:1 (если рН выше заданного значения), агар микробиологический - 18,0; питьевая вода - до 1 литра. (Промышленный регламент на производство вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций. ПР 01897080-09-09. Регистрационный №2134-09. 2009 г. 226 с.).

Недостатком данной среды является ее дороговизна.

Целью изобретения является получение качественной питательной среды плотной для культивирования микроорганизмов на основе вторичного продукта гидролизата говяжьего мяса, которая обеспечивает стабильный рост достаточного количества колоний на пластинках питательного агара.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда плотная в качестве питательной основы содержит вторичный продукт гидролизата говяжьего мяса, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический, с добавлением в среду стимулирующей добавки - натрия сернистокислого, а также дистиллированной воды при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Основа вторичного продукта гидролизата говяжьего мяса, содержащая, в среднем, 0,56% белка. Благодаря высокому содержанию пептидов - 17,5%; белка (по методу Бредфорда) - 106 мг %; общего белка (по Кьельдалю) - 2,1%; аминного азота - 0,98 мг %, углеводов - 0,15%; хлоридов - 1,8%, сухого остатка - 5,25%, вторичный продукт гидролизата говяжьего мяса является полноценной питательной основой для культивирования микроорганизмов.

Натрий хлористый 99,9%, хч, ГОСТ 4233-77, партия 246, срок годности 09.2019. Производитель ООО «НеваРеактив». Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Включение в состав среды натрия фосфорнокислого 2-замещенного 12-водного обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1989). (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6. - 2008. - С. 37-38).

Натрий сернистокислый ГОСТ 195-77, ЧДА, дата поступления 19.01.16 г., партия №15, порошок белого цвета, растворим в воде. Выдерживает испытание п. 3.4. ГОСТ 195-77. Определение щелочности, %, - не более 0,048. Массовая доля основного вещества, %, - не менее 99,1. Дата контроля 26.01.16 г. Срок хранения 6 месяцев. Изготовитель АО «Химический завод им. Л.Я. Карпова». Натрий сернистокислый является стимулятором роста микроорганизмов, источником серы и восстановителем окислительно-восстановительного потенциала питательной среды. Сера, присутствующая в натрии сернистокислом, необходима для белка клеток микроорганизмов в количестве 1%. Для подавляющего числа микроорганизмов, в том числе и патогенных, благоприятной средой для роста и размножения является среда с нейтральной реакцией (рН 7,0±0,5), поэтому уровень рН среды до нужного значения необходимо контролировать, этот фактор доводят до нужного использованием сернистых солей или кислот. Этим фактором и является натрий сернистокислый. При добавлении натрия сернистокислого среда становится прозрачнее.

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г. Порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85% не ниже 80°С, температура застудневания - 30-37°С, прочность студня - не менее 350±40 г. Главная особенность агара - его желирующая способность.

Дистиллированная вода ГОСТ 6709-72 отвечает всем гигиеническим требованиям. Внешний вид - прозрачная жидкость, хлориды, мг/дм : нет, нитраты, мг/дм³: нет. Удельная электропроводимость при 20°С, См/м - 0,38, рН - 6,5. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важнейшую роль в их физиологических функциях, а также входит состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например в реакциях гидролиза.

Приготовление основы вторичного продукта гидролизата говяжьего мяса для культивирования микроорганизмов.

Способ приготовления питательной основы для выращивания микроорганизмов заключается в следующем: оставшуюся после гидролиза говяжьего мяса и декантации жидкой фракции минерально-белковую субстанцию помещают в противни из нержавеющей стали равномерным слоем толщиной 0,8-1,0 см и замораживают в холодильной установке TEFCOLD SE-45 при температуре минус 39,0-40,0°С на протяжении 72 часов. Последующее высушивание замороженной субстанции осуществляют сублимационным способом в лиофильной сушилке ЛС-500 («Проинтех») при рабочем давлении в камере высушивания 85-95 Па, температуре конденсора - минус 49,0-50,0°С и общей длительности цикла сушки - 29 часов.

Остаточная влажность высушенной субстанции - 3-4%. Количество влаги в высушенных образцах вторичного продукта гидролизата говяжьего мяса измеряют с помощью анализатора влагосодержания MB 25 (Ohaus). Показатели учитывают при выбранной опции автоматического измерения с температурой нагрева до 100°С.

Высушенную субстанцию измельчают до порошкообразного состояния, помещают в сухую, чистую, герметично закрываемую тару и хранят при температуре не выше 25°С.

Полученную массу высушивают лиофильно с предварительным замораживанием при температуре минус 40,0±0,5°С в течение 72 часов при рабочем давлении в камере высушивания 8,0-9,0 Па при температуре конденсора минус 50,0±1°С, общей длительности цикла сушки 28 часов до остаточной влажности 9±1%. Затем из полученного порошка удаляют липиды при помощи петролейного эфира (ТУ 6-02-1244-83). Полученный белоксодержащий порошок впоследствии подвергают кислотному гидролизу по классической методике Козлова Ю.А. (1950) в собственной модификации, которая заключается в следующем: 40 граммов белоксодержащего порошка добавляют к 1 л 1% соляной кислоты (HCl) (х.ч., ГОСТ 3118-77), доводят рН до 3,28 и автоклавируют при температуре плюс 125°С в течение 60 мин. Затем гидролизат нейтрализуют 20% раствором натрия гидроокиси (NaOH) (ч.д.а., ГОСТ 4328-77) до рН 6,6±0,1, полученный раствор центрифугируют при 4800 оборотах в мин при температуре плюс 4°С, надосадочную жидкость фильтруют через 0,2 мкм стерилизующий фильтр (Sartorius). В фильтрате (гидролизате) аминный азот составляет 421±6 мг %, сухой остаток - 5,25±0,05%.

Приготовление питательной среды

Питательную среду на основе вторичного продукта гидролизата говяжьего мяса для культивирования микроорганизмов готовят следующим способом: взвешивают навеску основы вторичного продукта кислотного гидролизата говяжьего мяса в оптимальной дозе 30,0; затем добавляют натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 4,0; агар микробиологический - 8,0; дистиллированную воду - до 1 литра. Среду кипятят до полного растворения ингредиентов, затем устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем в фильтрат добавляют стимулирующую добавку - натрий сернистокислый - 0,25, разливают в градуированные флаконы по 200,0 мл, закрывают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт, стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 мин. После стерилизации охлаждают до 56°С, разливают в стерильные чашки Петри по 30 мл.

Согласно МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» М., 2008, для контроля специфической активности (чувствительности и стабильности основных биологических свойств микроорганизмов) готовых к употреблению плотных питательных сред для культивирования различных микроорганизмов используют тест-штаммы S. flexneri 1a 8516, S. sonnei «S-form», P. aeruginosa 27/99, S. plymuthica 1. Тест-штаммы S. flexneri 1a 8516 и S. sonnei «S-form» при посеве из разведения 10^-6 через 18-20 ч инкубации при температуре 37°С должны вырастать в виде изолированных бесцветных, прозрачных колоний. Тест-штаммы P. aeruginosa 27/99 и S. plymuthica 1 при посеве взвеси концентрацией 10¹ м.к./мл через 18-20 ч инкубации при температуре 37°С и 22°С, соответственно, должны образовывать ярко выраженные сине-зеленый и оранжево-красный пигменты, соответственно (МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» М., 2008, с. 46).

Подготовка тест-штаммов для контроля плотной питательной среды на основе вторичного продукта гидролизата говяжьего мяса для культивирования микроорганизмов.

Тест-штаммы S. flexneri la 8516, S. sonnei «S-form», P. aeruginosa 27/99, S. plymuthica 1 получают из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ России. Используемые для контроля тест-штаммы должны соответствовать паспортным данным.

Тест-штаммы хранят при температуре 2-8°С в лиофилизированном состоянии или на среде Романова (МУК 4.2.2316-08, с. 33) или на питательной среде следующего состава: питательный бульон сухой (СПБ) (ФСП 42-0504-5806-04) - 15,0 г или ГРМ-бульон (ФСП 42-0084-6559-05) - 20 г; агар микробиологический - 3,0 г; вода дистиллированная - 1,0 л, рН 7,2±0,2.

Пересевы культур со среды хранения на среду выращивания и вновь на среду хранения проводят через каждые 3 мес, но не более четырех раз.

I ПАССАЖ

Лиофилизированные культуры каждого тест-штамма S. flexneri 1a 8516, S. sonnei «S-form», P. aeruginosa 27/99, S. plymuthica 1 из ампулы или со среды хранения засевают на пробирку с питательным бульоном (СПБ или ГРМ-бульоном в пробирках), в пробирку и на чашку Петри с питательным агаром СПА (ФСП 42-0504-5807-04) или ГРМ-агаром (ФСП 42-0084-6558-05). Посевы с тест-штаммами S. flexneri 1a 8516, S. sonnei «S-form», P. aeruginosa 27/99 инкубируют в течение 18-20 ч при температуре (37±1)°С, с тест-штаммом S. plymuthica 1 - в течение 18-20 ч при температуре (22±2)°С. Выросшие на питательной среде культуры тест-штаммов проверяют визуально на чистоту роста и отсутствие диссоциации (МУК 4.2.2316-08, с. 30).

II ПАССАЖ

Культуру каждого тест-штамма пересевают на две пробирки и на чашку Петри с питательным агаром (СПА или ГРМ-агаром) (в случае отсутствия роста на питательном агаре используют культуру, выросшую в бульоне) и инкубируют в течение 18-20 ч тест-штаммы S. flexneri 1a 8516, S. sonnei «S-form», P. aeruginosa 27/99 при температуре (37±1)°C, S. plymuthica 1 - при температуре (22±2)°C. Выросшие культуры проверяют визуально на чистоту роста и используют для контроля.

Готовят взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по отраслевому стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-85 соответствующего года выпуска) ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ России, с использованием 0,9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси культур S. flexneri 1a 8516 и S. sonnei «S-form» титруют путем последовательных десятикратных разведений каждого тест-штамма до разведения 10^-6 в пробирках (ГОСТ 25336-82 Е). Каждое разведение делают отдельной пипеткой объемом 1 мл 2-го класса точности. Для P. aeruginosa 27/99 и S. plymuthica 1 используют взвесь, соответствующую 10 единицам по ОСО (это взвесь концентрацией 1×10¹ м.к./мл).

Посев тест-штаммов

По 0,1 мл микробной взвеси культуры каждого тест-штамма высевают на две чашки Петри с питательной средой плотной (ВПГГМ) для культивирования микроорганизмов: S. flexneri la 8516 и S. sonnei «S-form» из разведения 10^-6, P. aeruginosa 27/99 и S. plymuthica 1 - из суспензии, соответствующей 10 единицам, и стерильным шпателем распределяют взвесь по поверхности агаровой пластинки. Все чашки Петри с посевами S. flexneri la 8516; S. sonnei «S-form» и P aeruginosa 27/99 помещают на 18-20 ч для выращивания в термостате при температуре (37±1)°С, для тест-штамма Serratia plymuthica 1 - при температуре (22±1)°С.

Учет результатов

Через 18-20 ч инкубации тест-штаммов S. flexneri la 8516, S. sonnei «S-form», P. aeruginosa 27/99 при температуре (37±1)°C, a S. plymuthica 1 - через 18-20 ч при температуре (22±2)°С, определяют наличие и характер роста тест-штаммов. Определение проводят визуально.

Тест-штаммы Shigella flexneri 1a 8516 и S. sonnei «S-form» при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов из разведения 10^-6 через 18-20 ч инкубации при температуре (37±1)°С образуют бесцветные, прозрачные, выпуклые, круглые колоний диаметром 1,0-2,0 мм - S. flexneri 1a 8516 и 1,5-2,5 мм - S. sonnei «S-form». Выросшие культуры тест-штаммов Pseudomonas aeruginosa 27/99 и Serratia plymuthica 1 при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10 ед через 18-20 ч инкубации при температуре (37±1)°С для P. aeruginosa 27/99 и (22±1)°С для S. plymuthica 1 образуют сине-зеленый и оранжево-красный пигменты, соответственно.

Пример 1. Тест-штаммы выращивают на чашках Петри с питательной средой плотной на основе вторичного продукта гидролизата говяжьего мяса, содержащей, г/л: основу вторичного продукта гидролизата говяжьего мяса - 10,0; натрий хлористый - 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 3,0; натрий сернистокислый - 0,15; агар микробиологический - 6,0; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов через 18-20 ч инкубации при 37°С тест-штаммов S. flexneri 1a 8516 и S. sonnei «S-form» из разведения 10^-6 вырастают изолированные бесцветные, прозрачные, выпуклые, круглые колонии в недостаточном количестве :1 и 2, соответственно, диаметром 1,0 мм. Выросшие из суспензии, соответствующей 10 единицам, культуры P. aeruginosa 27/99 и S. plymuthica 1 образуют неярко выраженные сине-зеленый и оранжево-красный пигменты, соответственно.

Пример 2. Тест-штаммы выращивают на чашках Петри с питательной средой плотной на основе вторичного гидролизата говяжьего мяса, содержащей, г/л: основу вторичного продукта кислотного гидролизата говяжьего мяса - 30,0; натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 4,0; натрий сернистокислый - 0,25; агар микробиологический - 8,0; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов через 18-20 ч инкубации при 37°С тест-штаммов S. flexneri 1a 8516 и 51 sonnei «S-form» из разведения 10^-6 вырастают изолированные бесцветные, прозрачные, выпуклые, круглые колонии в достаточном количестве: 30 и 35, соответственно, диаметром 1,2-1,8 мм. Выросшие из суспензии, соответствующей 10 единицам, культуры P. aeruginosa 27/99 и S. plymuthica 1 образуют ярко выраженные сине-зеленый и оранжево-красный пигменты, соответственно.

Пример 3. Тест-штаммы выращивают на чашках Петри с питательной средой плотной на основе вторичного кислотного гидролизата говяжьего мяса, содержащей, г/л: основу вторичного гидролизата говяжьего мяса - 50,0; натрий хлористый - 6,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 5,0; натрий сернистокислый - 0,35; агар микробиологический - 10,0; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов через 18-20 ч инкубации при 37°С тест-штаммов S. flexneri 1a 8516 и S. sonnei «S form» из разведения 10^-6 вырастают изолированные бесцветные, прозрачные, выпуклые, круглые колонии в недостаточном количестве: 2 и 3, соответственно, диаметром 1,0-1,2 мм. Выросшие из суспензии, соответствующей 10 единицам, культуры P. aeruginosa 27/99 и S. plymuthica 1 образуют неярко выраженные сине-зеленый и оранжево-красный пигменты, соответственно.

Таким образом, заявленная питательная среда плотная на основе вторичного продукта гидролизата говяжьего мяса для культивирования микроорганизмов (пример 2) может применяться для культивирования различных микроорганизмов, т.к. удовлетворяет требованиям по специфической активности МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» М., 2008, на основании стабильного образования достаточного количества изолированных бесцветных, прозрачных колоний тест-штаммами S. flexneri 1a 8516 и S. sonnei «S-form» и образования пигментов сине-зеленого и оранжево-красного цвета тест-штаммами P. aeruginosa 27/99 и S. plymuthica 1, соответственно.