МУЛЬТИЭНЗИМНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЖИВОТНОВОДСТВА

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к разработке биотехнологической продукции - мультиэнзимной композиции (МЭК), предназначенной для использования в технологии производства комбикормов для с/х животных и птицы.

Отечественный и мировой опыт ведения животноводства убедительно свидетельствует, что полноценное кормление - это основа для проявления генетического потенциала продуктивности животных и эффективной трансформации питательных веществ корма в продукцию. Доказано, например, что наиболее полно свой генетический потенциал птица реализует на рационах, основу которых составляют кукуруза как источник обменной энергии и соевый шрот как наиболее сбалансированный по аминокислотам источник растительного протеина.

В настоящее время потребность кормопроизводства в белковых кормах удовлетворяется только на 45-50%. Это является главным фактором, лимитирующим рост производства продукции животноводства и птицеводства. В последние годы для решения проблемы кормового белка в кормлении с/х животных и птицы широко используют шроты белково-масличных культур - подсолнечника, сои, рапса и других.

Несмотря на высокую биологическую ценность растительных белковых кормов наличие «антипитательных» и ингибирующих факторов сдерживает их широкое применение. Зерно сои, например, уникально по содержанию питательных веществ, но продукты ее переработки, наряду с высоким содержанием белка (35-51%) и других ценных компонентов, содержат ядовитый белок соин, ингибиторы протеаз, трудногидролизуемые олигосахариды, факторы развития рахита, микотоксины, гемагглютинины и др. [1]. Соевый шрот рекомендовано контролировать также по активности уреазы, поскольку это связано с ингибитором трипсина, наличие которого оценивают по активности уреазы [2].

Для России в качестве источника кормового белка особое значение имеет подсолнечник и продукты его переработки, так как по объемам производства этой культуры наша страна занимает второе место в мире и их стоимость значительно ниже стоимости сои и соевых шротов. Содержание протеина в подсолнечном шроте (жмыхе) составляет 25-43% при пониженном уровне лизина и обменной энергии. По сравнению с соевым шротом в подсолнечном содержится большее количество некрахмальных полисахаридов (до 30%), таких как арабиноксиланы, пектины различной степени метоксилирования, олигосахариды, а также танины и др., которые отрицательно влияют на использование питательных веществ [1, 3]. Подсолнечный шрот содержит некрахмальные полисахариды сложной структуры (НПС), состоящей на 42% из целлюлозы, 24% из пектиновых соединений, 24% из 4-O-метилглюкуроно-ксиланов, 5% из глюкоманнанов и на 4,5% из фукоксилоглюканов [4]. К факторам, ограничивающим потребление подсолнечного шрота, относят хлорогеновую кислоту, уровень которой в нем не должен превышать 1%, так как повышенное содержание ее вызывает ингибирование пищеварительных ферментов (трипсина и липазы), а также снижение доступности метионина [2, 1]. Ограничение в применении имеют и другие белковые корма растительного происхождения, содержащие "антипитательные" факторы. Поэтому в рацион вводят подсолнечный жмых/шрот в количестве 7-10% для молодняка и 15-20% - для взрослой птицы, для молодняка и откорма свиней - 10-15%, для жвачных животных разных возрастных групп - 10-25 % [2, 3, 5].

Таким образом, дефицит кормового белка, сдерживающий развитие животноводства и птицеводства, диктует необходимость разработки способов повышения эффективности использования растительных белковых кормов за счет снижения или устранения присутствующих в них "антипитательных" и ингибирующих факторов с целью повышения норм ввода их в комбикормовую продукцию.

Известны способы предобработки растительного белкового сырья с целью устранения "антипитательных" факторов - замачивание, гидротермическая обработка, термообработка, инфракрасное облучение и др. Однако неусвояемые олигосахариды являются термостабильными соединениями и практически не разрушаются в результате применения различных видов технологических воздействий. Повышенное содержание ингибитора трипсина в белковом сырье (даже после термообработок) приводит к снижению активности эндогенных ферментов и ограничивает доступ метионина и цистина [1].

Учитывая специфичность состава некрахмальных полисахаридов (НПС) белкового сырья растительного происхождения, наличие в нем ингибиторов пищеварительных ферментов белковой и небелковой природы, неусвояемых олигосахаридов, а также ряда других негативных факторов (танины, лектины и др.), особое внимание было уделено комплексному подходу к решению проблемы повышения питательной ценности этого сырья. К наиболее эффективным и экономически целесообразным способам многофункционального воздействия на сложное по составу растительное сырье относится ферментативная обработка, при условии создания многокомпонентной системы ферментов целевого назначения. Эта композиция должна содержать определенный состав и соотношение ферментов, направленных на разрушение "антипитательных" веществ.

Для решения поставленной задачи было уделено внимание рассмотрению и отбору научно-технических материалов и патентных источников, характеризующих состояние проблемы.

Известны ферментные препараты фирмы БАСФ (Германия) - Натугрейн, Натугрейн Бленд и др. (Натуфос - 5000, Натуфос - 5000 G, Натуфос - 10000 G и Натуфос - 5000 L, которые содержат разный уровень фитазы) [6]. Препараты предназначены для рационов, содержащих преимущественно растительные (зерновые и белковые) компоненты. Особый интерес представляет комплексный ферментный препарат Натугрейн Бленд, который содержит сопутствующие ферменты - целлюлазу, гемицеллюлазы и протеазу. Необходимо отметить, что уровень ксиланазы в нем значительно превышает все известные препараты, содержащие этот фермент. По экспериментальным данным авторов заявляемого решения содержание ксиланазы (КсА) в препарате составляет 25000 ед./г (по действующей в РФ НТД), поэтому объяснимо, что он и рекомендован к использованию в составе пшенично-ячменных рационов, в том числе содержащих растительные белковые корма, для с/х птицы и свиней в дозе 80-100 г/т корма. Например, положительные результаты получены в опытах при включении в комбикорма 20% гороха. Продуктивность опытных цыплят повысилась по сравнению с контрольным вариантом на 3,1%, а затраты корма снизились на 4,2% [7]. Однако следует отметить, что при очень высокой активности КсА в препарате уровень сопутствующих ферментов достаточно низкий, особенно целлюлазы (ЦлА=245 ед./г), и введение его в дозе 0,1 кг/т не обеспечивает достаточного уровня этих ферментов в кормах в расчете на единицу сырья.

Известны ферментные препараты фирмы "Адиссео" (Франция) - Ровабио^TM Эксель, Ровабио Макс, Ровабио Бленд, предназначенные для использования в комбикормах разной зерновой основы с включением белковых растительных кормов (шроты, жмыхи, горох, люпин и др.). Наиболее широкие испытания в рационах с/х животных и птицы проведены с использованием препарата Ровабио^TM Эксель, содержащего ксиланазу (ведущий фермент), а также сопутствующие - β-глюканазу, целлюлазу, комплекс пектиназ, протеазы и другие, которые не регламентируются производителем. По данным фирмы и других исследователей комбинация ферментов, входящих в состав Ровабио, эффективно разрушает антипитательные вещества кормов и повышает уровень их обменной энергии (ОЭ) на 7-10%. В ряде опытов, проведенных с использованием Ровабио (50 г/т), показана эффективность применения его в кормлении бройлеров и кур-несушек: цыплята, получавшие рационы с повышенным содержанием ржи (до 50% со старта), подсолнечного шрота (до 25% со старта), не отличались по привесам и сохранности от контрольных групп, а продуктивность кур-несушек при вводе в их рацион отрубей - до 60%, овса - 40%, травяной муки - 25%, ржи - 35% - не снижалась. Аналогичные положительные результаты получены в рационах цыплят-бройлеров при выращивании их на комбикормах, содержащих до 30% подсолнечного жмыха (взамен рыбной муки и соевого шрота), и в рационах кур-несушек с включением 25% подсолнечного жмыха (взамен кукурузного глютена, рыбной муки и соевого шрота) [8-14].

ЗАО Биотехнологическая компания Восток разработала препараты Мультизимы Я, П и У, предназначенные для использования в рационах с/х животных и птицы, содержащих комбикорма разной зерновой основы, в том числе с повышенным введением жмыхов и шротов. В состав препаратов входят ферменты β-глюканаза, пектинлиаза, ксиланаза и протеаза [15-17]. Пектиназа мацерирующего действия (пектинлиаза) способствует разрушению низкометоксилированных пектинов, а также протопектина, но в меньшей степени влияет на деградацию пектиновых структур с повышенным содержанием метильных групп. Кроме того, по мнению авторов, из-за отсутствия α-галактозидазы, действующей на трудногидролизуемые олигосахариды сырья, поскольку только в соевом шроте наличие α-галактозидов составляет 50% от общего уровня некрахмальных полисахаридов (20%) [18], препараты не могут в полной мере решить проблему устранения основных "антипитательных" факторов используемых белковых кормов.

В последние годы появилась тенденция к совместному использованию ферментных препаратов, антибиотиков, пробиотиков, витаминов, окислителей, органических кислот и т.д., что, по данным исследователей, позволяет повысить эффективность их применения в рационах с/х животных и птицы [19-27].

Запатентована мультиэнзимная добавка для ферментативной обработки зерновых кормов - ржи и зерносмесей с содержанием 50% и более ржи, содержащая мультиэнзимную композицию МЭК-СХ-2 - 30%, Протосубтилин - 5% и солод ячменный - 65%, а для обработки ржаных отрубей добавка содержит: МЭК-СХ-2 - 40%, Протосубтилин - 5%, солод ячменный - 55%. Использование мультиэнзимной добавки в дозе 0,1% от воздушно-сухого вещества зернофуража повышает сумму сахаров в готовом корме до 300 г/кг и более, при низкой вязкости [28].

Установлено, что благодаря ферментному препарату Бацелл (производство Краснодарского биоцентра), который содержит целлюлазу, β-глюканазу, пектиназу + пробиотик, можно удешевить стоимость комбикормов за счет использования подсолнечного шрота (30%) в качестве единственного источника белкового корма, но при условии дополнительного введения лизина и растительного масла [19].

На рынке присутствует отечественный ферментный препарат Целло-Люкс-Ф (ранее Целловиридин - В Г20х), содержащий целлюлазу, ксиланазу, а также β-глюканазу и рекомендованный для использования в комбикормах, в том числе с включением белковых кормов растительного происхождения. Использование препарата (100 г/т) в комбикормах, содержащих 20% подсолнечного жмыха, 20-30% нешелушеного ячменя и 5-6% спиртовой барды, позволяет нивелировать отрицательное действие указанных компонентов, повысить продуктивность бройлеров и снизить затраты корма на ед. продукции на 8,7%. Отсутствие в препарате специфических ферментов, разрушающих α-галактозиды, ингибиторы трипсина, некоторые пектиновые вещества, по мнению авторов, не позволяет получать более значительный эффект. Комплексное использование препарата с Бациллихином оказалось более эффективным - 10,1% и 9,7% соответственно [21]. Проведены испытания препарата в сравнении с зарубежными препаратами аналогичного назначения (Ровабио, Роксазим G2 отдельно и в комплексе с Бациллихином) в рационах цыплят-бройлеров на фоне комбикормов разной зерновой основы (ячмень, рожь), содержащих белковые корма (горох - 20%, шрот подсолнечный - 20-30%). Установлено, что эффективность испытанных препаратов оказалась практически одинаковой [25].

Известен мультиэнзимный комплекс Экозим^TM (Голландия), содержащий эндоксиланазу, целлюлазу, β-глюканазу и предназначенный для комбикормов с повышенным уровнем НПС как зернового сырья (рожь, ячмень, овес, отруби, пшеница и т.д.), так и растительных белковых кормов - подсолнечный шрот/жмых, рапсовый жмых и т.д. (500-1000 г/т) [29].

Группа компаний Арсенал Гольджи представляет на российском рынке серию ферментных препаратов КСИБЕТЕН (торговая марка АД "БиоВет", Болгария). Ферментный препарат КСИБЕТЕН-ЦЕЛ (50-100 г/т) аналогичен хорошо известному препарату Целловиридин Г 20х, но, по данным фирмы, качественно отличается от него. Препарат КСИБЕТЕН-КСИЛ (75-200 г/т) характеризуется высокой ксиланазной активностью и содержит также целлюлазу и β-глюканазу. Препараты рекомендованы для использования в комбикормах разной зерновой основы (преимущественно ячмень, рожь, пшеница) с включением трудногидролизуемых компонентов, в том числе шротов и жмыхов [16, 30].

Датская фирма "Новозаймс" предлагает широкий ассортимент ферментных препаратов (Ронозим VX СТ, Ронозим VP СТ, Ронозим Р 5000 СТ, Ронозим Р и др.), предназначенных для включения в комбикорма, содержащие растительные белковые корма, в том числе бобовые культуры, шроты и жмыхи [31]. Из предлагаемых препаратов наиболее распространен Ронозим VP СТ, который содержит ведущий фермент β-глюканазу, высокий уровень пектиназы, а также ксиланазу и целлюлазу. Препарат применяется для повышения качества кормов (норма ввода 250-400 г/т) при включении в рацион моногастричных животных подсолнечного, или соевого, или рапсового шрота - до 30% [31].

Известны ферментные препараты производства Бельгии: Белфид Б (ксиланаза бактериальная) и Белфид Бета (β-глюканаза), которые рекомендованы к введению в комбикорма ячменно-пшеничной или пшенично-ячменной основы с добавлением подсолнечного шрота/жмыха. Испытания препарата Белфид Бета в рационах бройлеров на фоне ячменных рационов (15 и 40% нешелушеного ячменя по периодам выращивания) с добавлением 25% подсолнечного шрота показали, что живая масса цыплят на 1% превышает контроль (по нормам ВНИТИП) при более низких затратах на единицу продукции, при этом стоимость рациона снизилась на 14,0-15,5% [32]. Однако, по мнению авторов, отсутствие специфических ферментов, устраняющих "антипитательные" факторы подсолнечного шрота, не позволило получить более высокие результаты.

Известны ферментные препараты торговой марки Вильзим (АО "Биосинтезе", Литва) - Вильзим MR, MK и др., содержащие разный уровень активности ксиланазы, β-глюканазы, целлюлазы, амилазы, протеазы, и препарат MKF (с включением фитазы), предназначенные для комбикормов разной зерновой основы (ячмень, рожь, пшеница и др.), в том числе содержащих источники белковых кормов растительного происхождения. В частности, Вильзим MR, рекомендованный для пшенично-ржаных комбикормов с добавлением соевого, подсолнечного шротов и рапсового жмыха, характеризуется комплексом следующих ферментов: КсА - 1800 ед./г, ЦлА - 11-14 ед. (МЕ)/г, AC - 100 ед./г, β-ГлА - 1200-1300 ед./г, ПС - 1-2 ед./г. По материалам фирмы использование препаратов Вильзим повышает усвоение ОЭ на 4-10%, протеина и аминокислот - на 2-6%, улучшает микроклимат ферм и птичников и снижает себестоимость продукции на 3-6% [33].

Запатентован способ кормления кур, предусматривающий использование комбикормов на основе трудногидролизуемых компонентов, например, пшенично-ячменного типа, с добавлением подсолнечного шрота и мультиэнзимной композиции МЭК-СХ-3. При этом препарат добавляют в корм через день с начала яйцекладки и до конца продуктивного периода, в количестве 0,25-0,40% кг/т корма. Установлено, что переваримость сухого вещества корма повышается с 68% в контроле до 73-74% в опытном варианте. При этом яйценоскость птицы увеличивается на 3,4% [34].

Американская фирма "Оллтек" представляет на российском рынке группу ферментных препаратов для разных типов рационов, используемых в кормлении с/х животных и птицы. Среди них - Оллзайм ПТ, Оллзайм БГ, Оллзайм ФПД, Оллзайм Фитаза и Оллзайм Вегпро. Особую актуальность при проведении испытаний приобрел мультиэнзимный комплекс Оллзайм Вегпро, предназначенный для разрушения "антипитательных" веществ и усвояемости протеина и углеводов в белковых кормах растительного происхождения (бобовые культуры, жмыхи и шроты). По информации фирмы [35] препарат содержит комплекс ферментов - протеазу, целлюлазу, пентозаназу (ксиланазу), β-глюканазу и амилазу. Использование препарата является особенно эффективным в первые 20 дней жизни молодой птицы. Широкие испытания Оллзайм Вегпро проведены в рационах цыплят - бройлеров, кур-несушек промышленного стада, утят и др., которые показали, что его применение в количестве 1 кг/т повышает уровень ОЭ бобовых кормов и подсолнечника на 7-12%, усвояемость протеина и доступность аминокислот на 7-12% и, как следствие, способствует повышению питательной ценности шротов. В опытах было установлено, что с использованием Оллзайм Вегпро в комбикормах уровень подсолнечного шрота можно повысить до 30% без отрицательного влияния на продуктивность птицы [35, 36, 18, 39, 40, 23, 7].

Анализируя представленные материалы, следует отметить, что в них четко прослеживается тенденция применения уже известных, а также новых ферментных препаратов, преимущественно зарубежных, для решения существующей проблемы повышения эффективности использования белковых кормов растительного происхождения с целью увеличения норм их ввода в комбикормовую продукцию. Как правило, при характеристике препаратов зарубежного производства приводят только перечень отдельных ферментов, содержащихся в препаратах, и, в исключительных случаях, указывают количественное значение активностей ферментов, определенных по методикам фирм-производителей. По этой причине сравнительный анализ рекомендуемых ферментных препаратов для указанных целей не представляется возможным. Учитывая тот факт, что зарубежные препараты стандартизуют, в большинстве случаев, по активности одного фермента, наличие которого стабильно гарантировано в комбикорме, а уровень активностей сопутствующих ферментов при этом значительно различается в разных партиях одного и того же препарата при постоянном значении основного фермента, присутствие их в комбикормах может изменяться в значительных пределах.

Таким образом, многие ферментные препараты, предлагаемые на российском рынке для указанной цели, не в полной мере отвечают поставленной задаче, поскольку зачастую не содержат необходимого набора ферментных систем, способных эффективно устранять сложные трудногидролизуемые соединения белкового растительного сырья, наличие которых и определяет его "антипитательные" свойства. В препаратах, в основном, присутствуют ферменты, разрушающие НПС (целлюлоза, гемицеллюлозы и их производные), и практически отсутствуют ферменты (α-галактозидазы, эндополигалактуроназы, специфические протеазы), активно действующие на неусвояемые олигосахариды, а также ингибиторы протеаз, сложные пектиновые соединения и др. Так, препарат Ронозим VP СТ, рекомендованный для рационов, содержащих до 30% шрота - соевого, подсолнечного или рапсового, стандартизуют по β-глюканазе, а в качестве сопутствующих ферментов присутствуют эндополигалактуроназа, целлюлаза и ксиланаза. Уровни сопутствующих ферментов не могут быть гарантированы в препарате в постоянно одинаковых значениях, так как не регламентируются производителем. Это, в свою очередь, не может гарантировать их наличие и в комбикормах в постоянных значениях и, соответственно, обеспечить получение стабильных результатов на всех типах рационов, отличающихся разной структурой и составом компонентов, и, прежде всего, растительных белковых кормов.

Как указано ранее, мультиэнзимный комплекс фирмы "Оллтек", США - Оллзайм Вегпро предназначен для использования в комбикормах с включением повышенного уровня белковых кормов растительного происхождения (шроты, жмыхи, горох, люпин и др.). По информации фирмы в его состав входят: протеаза, а также целлюлаза, пентозаназа (ксиланаза), β-глюканаза и амилаза [35]. В рекламных материалах "Оллзаймы" этой же фирмы [36] при характеристике препарата Оллзайм Вегпро указано, что он содержит также фермент α-галактозидазу. В связи с этим в обзорной статье В. Кузьминой упоминается о наличии в этом препарате α-галактозидазы. Однако при определении активностей ферментов (по действующей в РФ НТД) трех образцов препарата Оллзайм Вегпро, полученных из разных источников, установлено, что при величинах активности протеазы (ПС) от 58 до 8 ед./г уровень целлюлазы (ЦлА) находится в пределах от 34 до 59 ед./г, ксиланазы (КсА) - от 70 до 160 ед./г, наличие α-галактозидазы не обнаружено. Но, ввиду широкого распространения препарата и полученных положительных результатов в опытах при испытаниях [37, 38, 39, 40, 18, 7], Оллзайм Вегпро выбран в качестве ближайшего аналога к заявляемой мультиэнзимной композиции. Кроме того, следует отметить, что и в рекламных материалах фирмы, и в опубликованных работах по эффективности использования Оллзайм Вегпро отсутствует информация о количественных значениях активностей ферментов, а полученные экспериментальные данные свидетельствуют о значительном разбросе этих величин, а также отсутствии фермента α-галактозидазы. С учетом изложенного, не представляется возможным определить соотношение ферментов в мультиэнзимном комплексе, и, в связи с этим, выбранный в качестве ближайшего аналога препарат Оллзайм Вегпро оценивали по наличию комплекса ферментов. Поэтому в настоящих материалах приведены сравнительные результаты по эффективности действия разработанной мультиэнзимной композиции и комплекса ферментов Оллзайм Вегпро на выбранные модели белкового растительного сырья.

Техническая задача, решаемая посредством реализации предлагаемой МЭК, состоит в повышении питательной и биологической ценности растительных белковых кормов за счет устранения их "антипитательных" и негативных факторов.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемой МЭК, состоит в обеспечении кормопроизводства растительными белковыми кормами высокого качества и повышении норм их ввода в комбикормовую продукцию, что будет способствовать снижению дефицита белка для животноводства.

Для достижения указанного технического результата предложена мультиэнзимная композиция на основе ферментов, контролируемых по единицам активности целлюлазы, ксиланазы, эндополигалактуроназы и α-галактозидазы, многокомпонентная система которой обеспечит оптимальный гидролиз сложных полисахаридов (целлюлозы, гемицеллюлоз, пектиновых соединений и др.), а также трудногидролизуемых олигосахаридов и ингибиторов трипсина.

Для устранения недостатков ближайшего аналога по набору ферментов в мультиэнзимную композицию, наряду с известными ферментами, дополнительно введены эндополигалактуроназа и α-галактозидаза, при соотношении единиц активностей контролируемых ферментов эндополигалактуроназы, ксиланазы и целлюлазы 1:(1,50-3,75):(0,30-0,75), а соотношение единиц активностей α-галактозидазы, ксиланазы и целлюлазы при этом составляет 1:(17,00-42,00):(3,50-8,50).

Характеристика белкового растительного сырья, предназначенного для ферментативной обработки, представлена в таблица 1.

Характеристика основных компонентов сырья была выполнена по действующей документации, количественное определение олигосахаридов вели с использованием высокоэффективного метода газожидкостной хроматографии, определение ингибиторов трипсина проводили модифицированным методом Эрлангера и др., с учетом методических рекомендаций фирмы Sigma - Aldrich Enzyme Explorer.

Для реализации заявляемого решения и с учетом того, что в ближайшем аналоге отсутствуют ферменты эндополигалактуроназа и α-галактозидаза, был проведен скрининг различных ферментных систем по выбору необходимых ферментов, в первую очередь указанных, для создания многокомпонентной системы целевого назначения, способствующих разрушению "антипитательных" факторов белкового растительного сырья (таблица 2).

Известно, что микробные ферментные препараты являются "комплексными", в которых, помимо основного фермента, присутствуют и сопутствующие, но отличающиеся разным уровнем активности. Например, при одном и том же уровне ЦлА в препаратах Целлюлазы содержание КсА (6200-8800 ед./г), β-ГлА (6500-11000 ед./г) и эндо-ПгА (600-1215 ед./г) существенно отличается. Аналогичная тенденция отмечена и в препаратах Ксиланазы по уровню ЦлА (24-1600 ед./г), β-ГлА (1650-13000 ед./г) и эндо-ПгА (220-1162 ед./г). Исследования ферментного комплекса препаратов Поликанесцина (разные партии) показало, что, помимо основной активности в них - эндополигалактуроназы, отмечено наличие α-галактозидазы (72-160 ед./г), незначительное содержание β-глюканазы, протеазы, ксиланазы и высокий уровень β-галактозидазы (920-3000 ед./г).

Пример осуществления изобретения

Для создания МЭК, в первую очередь, были проведены исследования по определению уровня активностей α-галактозидазы (α-ГалА) и эндополигалактуроназы (эндо-ПгА), необходимых для разрушения негативных факторов белкового сырья. С этой целью были проведены модельные опыты по ферментативной обработке шротов с использованием высокоочищенных ферментов α-ГалА и эндо-ПгА на фоне наличия в реакционной среде очищенной целлюлазы из расчета - ЦлА=750 ед./г при незначительном содержании ксиланазы. Введение целлюлазы необходимо для разрушения целлюлозосодержащих компонентов и повышения доступности неусвояемых олигосахаридов и пектиновых соединений сырья для воздействия соответствующих ферментов. Оценивали действие α-галактозидазы (α-ГалА) при уровне активностей от 70 до 150 ед., эндополигалактуроназы (эндо-ПгА) - 800-1300 ед./г. Критериями отбора оптимальных величин активностей этих ферментов служили показатели образующихся олигосахаридов и растворимой фракции пектина. Установлено, что при уровне α-ГалА в пределах 70-110 ед./г, наблюдается наибольшее разрушение олигосахаридов (28-32 %), а выход растворимой фракции пектина, при величине эндо-ПгА в пределах 900-1100 ед./г, увеличивается на 15-20%, по сравнению с контролем (целлюлаза). Дальнейшее повышение уровня α-ГалА (от 110 ед.) и эндо-ПгА (от 1100 ед.) не обеспечивало адекватного воздействия ферментов на изучаемые субстраты.

С целью определения допустимых пределов уровня активностей целлюлазы и ксиланазы для введения в состав заявляемой композиции были изготовлены экспериментальные образцы МЭК с установленными значениями α-ГалА и эндо-ПгА и проведена серия опытов по ферментолизу соевого и подсолнечного шротов (таблицы 3-6). Результаты ферментолиза оценивали по уровню углеводов [41].

Из анализа представленных данных следует, что, с учетом образующихся углеводов, допустимым пределом уровня целлюлазы (таблицы 3-4) в МЭК является диапазон ЦлА от 300 до 750 ед./г, а ксиланазы - от 1500 до 3750 ед./г, как для ферментолиза соевого, так и подсолнечного шротов. Снижение уровня ЦлА ниже 300 ед./г недостаточно эффективно, а повышение этой величины свыше 750 ед./г не выявило адекватного изменения содержания углеводов. Аналогичная тенденция отмечена и в тех вариантах с ксиланазой, в которых КсА ниже 1500 и выше 3750 ед./г (таблицы 5-6).

С учетом данных, представленных в таблице 2, и полученных результатов (таблицы 3-6) отобраны препараты, содержащие высокий уровень ферментов, необходимых для осуществления поставленной задачи, из которых были изготовлены опытные образцы мультиэнзимных композиций (МЭК) шести вариантов (по 50 г каждый) с разными соотношениями контролируемых ферментов в мультисистемах (таблица 7).

Для оценки эффективности мультиэнзимных композиций были проведены исследования процессов ферментолиза полисахаридов белкового растительного сырья (на двух моделях - шрот соевый и шрот подсолнечный) по сравнению с ближайшим аналогом. О действии МЭК судили по изменению в реакционной среде количества восстанавливающих сахаров, водорастворимого пектина, гемицеллюлоз, целлюлозы, а также крахмала [41]. Кроме того, исследовали эффективность МЭК по действию на олигосахариды и ингибиторы трипсина, о чем судили по изменению уровня содержащихся в белковом сырье основных α-галактозидов и ингибиторов трипсина, а также по проявлению активности трипсина с использованием синтетического субстрата α-бензоил - аргинин-пара-нитроанилида [42-43].

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Пример 1. Воздействие МЭК на содержание фракций углеводов соевого шрота в зависимости от соотношения ферментов (таблица 8).

Из анализа данных таблицы 8 следует, что ферментативная обработка сырья комплексом ферментов во всех опытных вариантах способствует интенсификации процессов разрушения углеводов соевого шрота по сравнению с контролем. Наилучшие результаты по образованию восстанавливающих сахаров, растворимого пектина, уменьшению содержания гемицеллюлоз и целлюлозы получены в вариантах МЭК 2-5. Так, сахара увеличиваются с 0,79% в контроле до 1,86-1,92% в опытных вариантах, растворимый пектин - с 1,66% до 3,83-4,0%, снижается уровень гемицеллюлоз и целлюлозы с 5,76-4,06% в контроле до 4,40-4,44 и 2,31-2,44% соответственно. Как видно из таблицы 8, эффективность действия ближайшего аналога на углеводы шрота значительно уступает опытным вариантам, хотя и превосходит контроль, вследствие того что в препарате Оллзайм Вегпро содержится низкий уровень комплекса целлюлаз и отсутствует эндополигалактуроназа, которая действует не только на пектиновые соединения, но способствует разрушению целлюлозы и гемицеллюлоз. Изменения соотношения контролируемых ферментов в вариантах 1 и 6 не улучшило изучаемые показатели. Следовательно, соотношения единиц активностей ферментов эндополигалактуроназы к ксиланазе и целлюлазе, а α-галактозидазы к ксиланазе и целлюлазе, составляющие 1:(1,50-3,75):(0,30-0,75) и 1:(17,00-42,00):(3,50-8,50), являются оптимальными для процессов ферментолиза соевого шрота.

Пример 2. Воздействие МЭК на содержание фракций углеводов подсолнечного шрота в зависимости от соотношения ферментов (таблица 9).

Аналогичная тенденция по изменению углеводного состава обрабатываемого сырья отмечена и при изучении процессов ферментолиза подсолнечного шрота (таблица 9). Соотношения контролируемых ферментов в опытных вариантах МЭК (2-5) также обеспечивают оптимальный гидролиз НПС шрота по сравнению с контролем и ближайшим аналогом. При этом уровень восстанавливающих сахаров в этих вариантах находится в пределах 2,93-3,11%, растворимого пектина 2,36-2,42%, гемицеллюлоз - 4,16-4,20%, целлюлозы - 4,62-4,72% против контроля - 1,21; 1,33; 6,44 и 6,88% соответственно. По степени разрушения углеводов подсолнечного шрота ближайший аналог Оллзайм Вегпро также существенно уступает опытным вариантам, хотя и превосходит контроль.

Пример 3. Эффективность действия МЭК на изменение содержания олигосахаридов и трипсинового ингибитора в соевом шроте (таблица 10).

В таблице 10 показаны результаты действия МЭК на изменение содержания олигосахаридов и трипсинового ингибитора в соевом шроте. Из таблицы видно, что неусвояемые олигосахариды соевого шрота подвергаются воздействию комплекса ферментов МЭК и ближайшего аналога, но в различной степени. Так, содержание стахиозы снижается с 4,40% в контроле до 3,80-2,20% в опытных вариантах, рафинозы - с 0,89% до 0,45-0,31%, в наибольшей степени подвержена гидролизу сахароза. Действие комплекса ферментов ближайшего аналога Оллзайм Вегпро оказалось практически неэффективным, что, по мнению авторов, объясняется отсутствием или следовыми количествами фермента α-галактозидазы в Оллзайм Вегпро. Анализ данных показал, что наилучшие результаты по разрушению олигосахаридов отмечены также в вариантах МЭК 2-5 как по сравнению с контролем, так и с ближайшим аналогом. Этот вывод подтверждается и данными по разрушению

ингибиторов трипсина соевого шрота под действием лучших опытных вариантов МЭК по сравнению с контролем. Так, за 3 часа экспозиции (t - 40°С, рН - 6,0) содержание ингибиторов снижается с 11,89 мг/г в контроле до 3,12-3,10 мг/г в опытных вариантах, что коррелируется с потерями активности трипсина - с 93,5% в контроле до 31,0-29,2% в вариантах 2-5. Увеличение продолжительности экспозиции до 5 часов существенно не меняет изучаемые показатели. Комплекс ферментов ближайшего аналога также эффективно действует на разрушение ингибиторов (4,80 мг/г), что подтверждается сохранением активности трипсина на 63,6% против 6,5% в контроле и 69,0-70,8% в лучших опытных вариантах.

Пример 4. Эффективность действия МЭК на изменение содержания олигосахаридов и трипсинового ингибитора в подсолнечном шроте (таблица 11).

Аналогичная тенденция разрушения "антипитательных" факторов установлена и при ферментативной обработке подсолнечного шрота (таблица 11). Наилучшие результаты по разрушению сахарозы и рафинозы получены также при действии на сырье опытных вариантов МЭК (2-5). Так, содержание рафинозы по сравнению с контролем снижается с 3,30% в контроле до 1,42-1,48% в опытных вариантах, то есть в среднем на 55,9%, тогда как при действии комплекса ферментов ближайшего аналога на 4,5%, что также, по мнению авторов, объясняется отсутствием в этом препарате α-галактозидазы. Подобная картина наблюдается и при разрушении сахарозы: под действием МЭК ее содержание снижается на 41,3% по сравнению с контролем и на 30,0% - с ближайшим аналогом.

Как видно из данных таблицы 11, содержание ингибиторов трипсина в подсолнечном шроте значительно меньше (в 5 раз), чем в соевом (11,89 мг/г). Однако, судя по потерям активности трипсина под действием МЭК (2-5) и

ближайшего аналога, можно отметить, что Оллзайм Вегпро уступает опытным вариантам МЭК - 59,1% против 47,8-49,1% соответственно.

На основании проведенных исследований следует заключить, что заявляемая мультиэнзимная композиция, содержащая эндополигалактуроназу, α-галактозидазу, целлюлазу и ксиланазу в соотношениях единиц активностей: эндоПгА: КсА:ЦлА 1:(1,50-3,75):(0,30-0,75) и α-ГалА:КсА:ЦлА - 1:(17,00-42,00):(3,50-8,50), является оптимальной, обеспечивающей в максимальной степени разрушение "антипитательных" факторов белкового растительного сырья (целлюлоза, гемицеллюлозы, пектин, олигосахариды, ингибиторы трипсина) по сравнению с ближайшим аналогом.

Мультиэнзимные композиции по заявляемому решению были испытаны в рационах с/х животных и птицы (таблицы 12-16).

Пример 5. Эффективность МЭК по заявляемому решению в рационах поросят (таблица 12).

В экспериментальном хозяйстве ВИЖа "Кленово-Чегодаево" были проведены испытания МЭК в рационах 3-х групп поросят по десять голов в каждой. Для поросят контрольной и опытной групп был приготовлен полнорационный комбикорм следующего состава (%): ячмень - 40, пшеница фуражная - 27, отруби пшеничные - 5, жмых подсолнечный - 10, шрот соевый - 15, соль поваренная - 0,3, мел кормовой - 0,7, дикальцийфосфат - 1,0, премикс П-53 - 1,0. В 1 кг комбикорма содержалось 12,7 МДж обменной энергии, 193 г сырого протеина, 8,7 г лизина, 5,9 г метионина с цистином. Опытные поросята получали в составе комбикорма 0,075% (1 опытн. группа) и 0,1% (2 опытн. группа) МЭК. В таблице 12 представлены результаты опыта по испытаниям МЭК в рационах выращиваемых поросят.

Из таблицы 12 видно, что использование МЭК в составе комбикормов при выращивании поросят оказало положительное влияние на зоотехнические показатели. Так, живая масса поросят опытных групп за период выращивания превосходила контроль на 6,1-8,9 кг, а среднесуточные приросты оказались на 20,3-28,3% выше, чем контрольные животные, причем лучшие результаты получены в группе, получавшей 0,1% (от массы) МЭК.

Поскольку поросята всех групп потребляли одинаковое количество комбикормов, конверсия корма зависела только от прироста живой массы. В этой связи затраты комбикорма на 1 кг прироста в опытных группах были ниже контроля на 0,82-1,07 кг или на 16,9-22,1%.

При расчете экономической эффективности выращивания поросят установлено, что общие затраты на прирост живой массы в опытных группах превышали контроль на 114,49-158,84 руб. Однако это не отразилось на себестоимости 1 кг прироста, которая в опытных группах была ниже - 5,58-7,33 руб. или - на 11,8-16,1%. От поросят опытных групп получена дополнительная, по сравнению с контролем, прибыль в размере 204,51-286,66 руб. Обогащение полнорационного комбикорма мультиэнзимной композицией позволило повысить рентабельность выращивания поросят на 12,4-16,9 абс.%.

Пример 6. Эффективность МЭК по заявляемому решению в рационах цыплят-бройлеров (таблицы 13-14).

В условиях "Загорское ЭПХ ВНИТИП" были проведены научно-хозяйственные опыты на четырех группах бройлеров кросса "Кобб авиан". В каждой группе было по 35 голов цыплят, срок выращивания - 40 дней. Первая группа - контрольная - получала комбикорм с питательностью, соответствующей нормам ВНИТИП (2003 г.); вторая группа - контрольная - получала комбикорм с включением 28,85% соевого и подсолнечного жмыхов, в том числе 20% подсолнечного; третья группа получала рацион второй группы + 0,1% (от массы) МЭК и четвертая группа получала комбикорм, содержащий 32,2% жмыхов, в том числе 30% - подсолнечного + МЭК (0,1%). В таблице 13 показаны состав и питательность комбикормов для бройлеров первого и второго периодов выращивания.

В таблице 14 представлены данные по зоотехническим показателям выращивания бройлеров.

Как видно из таблицы 14, живая масса цыплят в группе 2 (отрицательный контроль) за период выращивания, получавшей 20% подсолнечного жмыха, не достигла уровня контрольной группы 1 и была ниже на 6,2% (Р<0,05). Использование мультиэнзимной композиции в комбикормах с 20% (группа 3) и 30% (группа 4) подсолнечного жмыха позволило повысить живую массу бройлеров по сравнению с контрольной группой 2 на 8,6% (Р<0,01) и 6,7% (Р<0,05) и была практически на уровне контрольной группы 1, получавшей полнорационный комбикорм (по нормам ВНИТИП). В группах 3 и 4 были более низкие затраты корма на 1 кг прироста живой массы: разница по сравнению с контрольной группой 1 составила 2,7% в группе 3 и 1,6% в группе 4. По отношению к контрольной группе 2 различия были более заметными: на 9,2 и 8,2% соответственно.

Использование МЭК в комбикормах, содержащих только соевый и подсолнечный жмыхи в количестве 28,85% в первый период выращивания и 32,2% во второй период выращивания, в том числе 20 и 30% подсолнечного жмыха, позволило повысить переваримость сухого вещества корма в 3 и 4 группах на 1,9 и 1,1% по сравнению с контролем 1 и на 5,4-4,6% по сравнению с контролем 2, разница по переваримости протеина составила 1,3-0,8% и 3,1-2,6%, а жира - 2,7-1,8% и 7,8-6,9% соответственно. Наиболее значительными были различия между опытными и контрольными группами по переваримости клетчатки корма. Так, в опытных группах этот показатель увеличился на 13,2-11,8% по сравнению с контролем 1 и на 21,3-19,9% по сравнению с контролем 2. Азот корма под влиянием мультиэнзимной композиции использовался бройлерами группы 3 лучше на 4,3-7,6% по сравнению с контрольными группами 1 и 2, группы 4 - на 3,2-6,5% соответственно.

Результаты опыта позволяют сделать заключение об эффективности применения мультиэнзимной композиции в комбикормах для бройлеров, содержащих повышенные уровни подсолнечного жмыха - 20-30%. Снижение уровня обменной энергии в комбикорме с 30% подсолнечного жмыха (группа 4) не оказало отрицательного влияния на результаты выращивания бройлеров по сравнению с контрольной группой 1, получавшей полнорационный комбикорм. Это свидетельствует о высокой эффективности мультиэнзимной композиции по заявляемому решению.

Пример 7. Эффективность МЭК по заявляемому решению в рационах телят (таблицы 15-16).

В экспериментальном хозяйстве ВИЖа "Кленово-Чегодаево" был проведен научно-хозяйственный опыт на трех группах телят по 8 голов в каждой. Основной рацион (ОР) состоял из цельного молока, сена злаково-бобового, силоса кукурузного и комбикорма-стартера (СК). Животные контрольной группы получали ОР+СК, для животных 1 опытной группы в состав СК вводили 0,05% МЭК, в состав 2 опытной группы - 0,1% МЭК (таблица 15).

В таблице 16 представлены данные по зоотехническим показателям при выращивании телят с использованием МЭК по заявляемому решению.

Из таблицы 16 видно, что использование МЭК в составе рационов при выращивании телят позволяет повысить живую массу животных на 11-16%, причем наилучшие среднесуточные приросты живой массы получены во второй опытной группе, которая получала в составе СК 0,1% МЭК. Положительный эффект внесения МЭК подтверждается и затратами кормов на единицу продукции. Так, на производство 1 кг прироста во 2-й опытной группе было израсходовано 1877 г комбикорма против 1909 в контрольной и 1965 г в 1-й опытной, что говорит о том, что животные 2-й опытной группы эффективнее использовали питательные вещества рационов, поэтому оплата корма продукцией была выше.

По результатам балансового опыта было установлено, что внесение МЭК в комбикорма способствовало повышению переваримости практически всех питательных веществ рациона. Так, переваримость сухого вещества в опытных группах была на 4,3-7,3; органического вещества - на 3,3-6,5; протеина - на 3,3-5,9; БЭВ - на 2,1-6,7 абс.% выше по сравнению с контролем. Кроме того, у телят 2-й опытной группы ретенция азота была выше на 8,6 г по сравнению с контролем, лучше было и использование азота - на 11,2 абс.%.

Список литературы

1. Корма и биологически активные добавки для птицы. - М.: Колос, 1999. - 93 с.

2. Рекомендации по кормлению сельскохозяйственной птицы /РАСХН, МНТЦ "Племптица", ВНИТИП. // Сергиев Посад: 2006. - 142 с.

3. Нетрадиционные корма и кормовые добавки/ Мальцев А.Б., Спиридонов И.П., Давыдов В.М. // Омск: ГНУ Сиб. НИИ птицеводства РАСХН, 2005. - 702 с.

4. Meeusen A. Vegetable - based feeds // Zootecnica. - 2002. - №9. - P.48-54.

5. Методические рекомендации для расчета рецептов комбикормовой продукции / МСХ РФ, ОАО "ВНИИ комбикормовой промышленности/ - М., 2003.

6. Материалы фирмы BASF (Германия) - 2004.

7. Околелова Т. Использование гороха при производстве мяса бройлеров// Комбикорма. - 2004. - № 4. - С.40-41.

8. Околелова Т., Бевзюк В., Молоскин С., Варжина Т. Ровабио - универсальный фермент в кормах для птицы // Животноводство России. - 2003. - №10. - С.6-9.

9. Околелова Т., Молоскин С., Грачев Д. Ровабио для бройлеров// Комбикорма. - 2006. - №8. - С.85.

10. Околелова Т., Молоскин С. Новое в использовании подсолнечного жмыха в комбикормах для птицы // Комбикорма. - 2002. - № 3. - С.50-52.

11. Егоров И. Использование комбикормов, содержащих полножирные семена подсолнечника, голозерный овес и просо обычных сортов с применением фермента // Птицефабрика. - 2006. - №10. - С.9-12.

12. Околелова Т., Молоскин С., Грачев Д. Ровабио Макс в комбикормах для бройлеров // Птицеводство. - 2007. - №1. - С.19.

13. Феодориди Р., Кривко В., Скидан В., Маркова Д., Тимошинов В. Ферменты для повышения качества корма // Комбикорма. - 2004. - №7. - С.49.

14. Молоскин А. Универсальный фермент для зерновых рационов // Комбикорма. - №1. - 2003. - С.56-57.

15. Трошкин В. Новые разработки биотехнологической компании // Комбикорма. - 2006. - №2. - С.53.

16. Борисов Д., Гейнель В. Фермент в рационах с нутом и льняным жмыхом // Комбикорма. - 2006. - №4. - С.62.

17. Ленкова Т. Мультизимы в комбикормах для бройлеров //Птицеводство. - 2007. - №2. - С.15.

18. Кузьмина В. Фермент - неотъемлемая часть рационов // Комбикорма. - 2004. - №3. - С.70-71.

19. Рядчиков В., Скакун М., Мхитарян В., Павлов Н., Ромазев Е. Подсолнечный шрот-белковая основа рациона: Оценка ферментного препарата "Бацелл"// Птицеводство. - 2004. - №10. - С.5-7.

20. Околелова Т., Криворучко Л., Морозов А., Румянцев С. Как повысить эффективность ферментов в комбикормах для птицы // Комбикорма. - 2005. - №3. - С.59.

21. Ленкова Т., Меньшенин И., Соколова Т. Ферментные препараты в кормах пониженной питательности // Комбикорма. - 2007. - №6. - С.83-84.

22. Садовая С. Витамин С и ферментный препарат в комбикормах для утят // Комбикорма. - 2007. - №2. - С.77.

23. Садовая С., Бухгалтер Н., Маслов М., Корнилова В. Витамин С и Оллзайм Вегпро в кормлении цыплят // Птицеводство. - 2007. - №3. - С.17.

24. Кузнецова Т. Влияние Ксибетена в комплексе с флавомицином на качество яиц // Птицеводство. - 2007. - №1. - С.20-21.

25. Удальева С., Франк Р. Целловиридин В-Г 20х в рационах бройлеров // Птицеводство. - 2005. - №7. - С.12-13.

26. Околелова Т., Криворучко Л., Морозов А., Румянцев С. Ксибетен плюс фармастим - двойная сила // Птицеводство. - 2005. - №3. - С.11-12.

27. Пат. 02237418 РФ, МКИ⁵ А23К 1/165. Способ кормления цыплят-бройлеров / А.Е.Чиков, Л.Н.Лихобабина (РФ). - Опубл. 10.10.2004, Бюл. №28.

28. Пат. 022364459 РФ, МКИ⁵ А23К 1/165. Мультиэнзимная добавка для ферментативной обработки зерновых кормов / Ш.К.Шакиров, Р.У.Бикташев, Ф.С.Гибадуллина, P.P.Бикбов (РФ). - Опубл. 20.09.2004, Бюл. №26.

29. Материалы фирмы ТЕХВЕТ "Мультиэнзимные композиции".

30. Материалы фирмы AD Biovet (Болгария).

31. Материалы фирмы Новозаймс (Дания).

32. Околелова Т., Криворучко Л., Андрианова Е., Новиков В., Лабунов С., Евсиевич Ю. Эффективность препарата Белфид // Птицеводство. - 2007. - №1. - С.22-23.

33. Материалы фирмы АО "Биосинтезе" (Литва).

34. Пат. 2156581 РФ, МКИ⁵ А23К 1/165. Способ кормления кур / В.И.Фисинин, В.В. Романенко, Ш.А.Имангулов, И.А.Егоров, Т.Н.Ленкова, Т.Ф.Борисова (РФ).

35. Применение биотехнологии для интенсификации животноводства (Материалы фирмы Оллтек, США).

36. Оллзаймы^ТМ - рекламные материалы фирмы "Оллтек" (США).

37. Такер Л. Эффективное использование ферментов для пшенично-ячменных рационов птицы // Птицефабрика. - 2006. - №5. - С.28-32.

38. Пирс Д. Ферменты в кормлении птицы // Птицефабрика. - 2004. - №6. - С.31-36.

39. Околелова Т., Кузьмина В. Оллзайм Вегпро - фермент, улучшающий усвоение подсолнечного шрота // Птица и птицепродукты. - 2004. - №6. - С.76-77.

40. Околелова Т., Савченко С., Орел Д. Один фермент и двойная сила подсолнечного шрота // Птицеводство. - 2004. - №12. - С.6-7.

41. Газдаров В.М. и др. Последовательный анализ углеводов в кормах и химусе птицы // Бюллетень ВНИИФБиП с/х животных/ Боровск. - 1988. - Вып.4. - С.73-75.

42. В.F.Erlanger, N.Kokowsky, W.Cohen. The preparation and properties of two new chromogenis substrates oftrypsin // Arch. Biochem. Biophys. - 1961. - №95. - P.271-278.

43. Саменкова Н.Ф. Использование высокоочищенных ферментов и ингибиторов ферментов трипсинового ряда для стандартизации их медицинских препаратов: Автореф. дис. канд. б. наук: М., 1982. - 25 с.