Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЛЕЙ ФИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В СЕМЕНАХ РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к аналитической химии, предназначено для определения органического соединения фитина в семенах растений.

Фитин является основным фосфорсодержащим компонентом клеток многих растений и играет значительную роль в процессах прорастания семян, ускоренного роста и накопления биомассы. Основными проблемами при определении содержания солей фитиновой кислоты является его труднодоступность в связи с плохой растворимостью как в спирте, так и водных растворах, а также большим содержанием жиров и белков в семенах.

Известен способ выделения концентрата фитина из рисовых отрубей (JPS 6058993, МПК C07C 27/00; C07C 29/12; C07C 35/16; C07C 67/00; C07F 9/117, опубл. 1985-04-05), согласно которому рисовые отруби перемешивают с растворителем, например, н-гексаном и оставляют до образования сверху белой суспензии, содержащей фитин. Известен способ экстракции и очистки фитина из рисовых отходов с помощью обработки 1% раствором азотной кислоты, с последующим осаждением 10% известковым молоком и фильтрацией на прессе (Патент №2171808 C07F 9/117, опубл. 10.08.2001). Полученный технический фитин перекристаллизовывают 10% азотной кислотой, затем осаждают, сушат. Недостатком метода является его многостадийность, не приводящая, однако, к получению высокоочищенного от органических и неорганических примесей препарата, что затрудняет точное определение его концентрации. При этом работы по очистке фитина проводятся на холоду для предотвращения действия фермента фитазы, расщепляющей фитин на низкомолекулярные компоненты.

Известен способ количественного определения фитина с применением реактива Вэйда, включающего сульфосалициловую кислоту в присутствии соли трехвалентного хлористого железа FeCl3⋅6Н₂О (Latta М., Eskin М.А simple and rapid colorimetric method for phytate determination // J. Agric. Food Chem. 1980. №28. P. 1313-1315). Недостатком метода является зависимость окраски результирующей смеси от pH среды: в зависимости от кислотности применяется измерение концентрации фитина при трех разных длинах волн. Кроме того, метод не дает точных значений, приходится делать много повторностей, что не всегда возможно, а результирующая смесь имеет нестабильную окраску (не более 1-2 минут).

Известен метод определения фитина с помощью железо-тиоцианатного комплекса (Демьянов Н.Я. Общие приемы анализа растительных веществ. М.: Государственное издательство, 1923. 252 с.), измерение проводят при длине волны 470 нм. Недостатком данного метода является крайняя нестабильность окраски (не более 1 минуты), а также значительный разброс данных, что связано с отсутствием применения оптимальной длины поглощения продукта реакции.

Известен способ количественного анализа фитина в растительных кормах, взятый за прототип, по АС 1432399 (опубл. 23.10.1988), включающий экстракцию фитина соляной кислотой, отделение экстракта от нерастворившегося осадка центрифугированием, пропускание экстракта через хроматографическую колонку с сильнокислотным катеонитом, содержащим 0,1-1 мг-экв железа в 1 г катионита, элюирование фитинового комплекса с железом из колонки 0,4-0,8 MHCl и определение фитина спектрофотометрически в УФ-спектре по светопоглощению фитинового комплекса с железом, при этом используется раствор сравнения, при экстрагировании используется 0,33-0,35 M HCl, а спектрофотомерию проводят при 240 нм. К недостаткам метода можно отнести сложность и большую затратность за счет использования оборудования ЖХ (ВЭЖХ). Кроме того метод дает избыточную точность для сравнительного анализа объектов исследования.

Заявленное изобретение решает задачу выделения из семян, очищенных от жиров и белков, соединений фитиновой кислоты (фитинатов), определения содержания фитина в семенах получением стойкой окраски при использовании железо-тиоцианатного комплекса, снижения погрешности измерения до ±10% абсолютной массы фитина в навеске, работать при комнатной температуре.

Технический результат заключается в повышении точности и упрощении измерения количественного содержания фитина за счет получения абсолютно прозрачных образцов, стабилизации окраски до 10 минут, а также в разработке способа, пригодного для определения фитина при низкой концентрации от 0,08 до 4 мг на 1 г сырья.

Технический результат достигается тем, что в способе определения солей фитиновой кислоты в семенах растений, включающем экстракцию фитина из сырья соляной кислотой, центрифугирование полученной смеси, колориметрирование при длине волны 337 нм, согласно изобретению, проводится дополнительная очистка солянокислой вытяжки добавлением к ней в соотношение объемов 4:1 смеси изоамилового спирта с хлороформом (1:24 об. долей) и перемешиванием, к полученной после центрифугирования надосадочной жидкости добавляют раствор 0.03% роданида аммония NH₄SCN в 6% HCl и раствор 0.86% FeCl₃ и 0.2% HCl в дистилированой воде в объемном соотношении 1:1,5:1, колориметрирование проводят, принимая в качестве контроля смесь этих же растворов в тех же пропорциях, заменяя объем надосадочной жидкости равным объемом воды, определение абсолютной массы f (мг) фитина в навеске пробы проводят по градировочному графику, а концентрацию F (%) определяют по формуле F=100f/Mn, где M_n - масса навески пробы (мг).

Авторами настоящего изобретения на Международной научной конференции по биологической химии «XII чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, ИБХ РАН, 18-22 сентября) был сделан доклад с примером осуществления заявляемого способа на плодах ореха (Измерение содержания фитина в плодах четырех видов ореха на основе модифицированного колориметрического метода. Ф, Р. Аль Хачами, О.А. Землянухина, В.Н. Епринцев, В.Н. Калаев, Н.Н. Черкасова, В.А. Славский

// под ред. В.Т. Иванова, А.Г. Габибова. - М.: Издательство «Перо», 2017. - с. 179).

В заявляемом изобретении использован метод очистки семян от содержания жиров и белков, применяемый обычно при выделении растительной ДНК.

Определение содержания фитина в полученной надосадочной жидкости проводят с использованием железо-тиоцианатного комплекса. На нанофотометре IMPLEN Р330 (Германия) был определен максимум поглощения тиоцианата. Он составляет 337 нм, что позволяет продлить стабильность окраски реакции до 10 мин и повысить точность измерения с использованием меньшего числа повторностей.

Метод основан на способности анионов солей фитиновой кислоты конкурировать с анионом роданида, дающим в растворе окрашенное труднорастворимое соединение с трехвалентным железом (тиоцианат). Таким образом, концентрация фитина обратно пропорциональна концентрации образованного тиоцианата железа (оптической плотности окрашенного раствора). Зная соотношение взаимодействующих компонентов реакции (4 Fe:l фитинат), можно определить концентрацию фитина по концентрации остаточного железа согласно стехиометрическому закону.

Пример осуществления способа.

Для очистки растительного материала (20-300 мг) к 2 мл гомогената, растертого для лучшего разрушения семян с битым стеклом в 0.5 М HCl (раствор №1), добавляется 0.5 мл раствора изоамилового спирта с хлороформом (1:24) (раствор №2). После чего смесь переносили в эппендорфы и энергично встряхивали в течение 1 мин, после чего центрифугировали в течение 3 мин при 20000 g на центрифуге СМ50 ELMI (Латвия). При этом получали абсолютно прозрачную, очищенную от примесей надосадочную жидкость, содержащую соли фитиновой кислоты.

Ход измерения.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют сначала 1.5 мл индикативного 0.03% кислого раствора роданида аммония NH₄SCN в 6% HCl (раствор №3), затем прибавляли 50 мкл кислого конкурентного раствора хлорида железа(III) (раствор №4). Раствор хлорида железа готовят из соли FeCl₃, высушенной в эксикаторе с концентрированной серной кислотой. Содержание раствора представляет собой 0.86% по FeCl₃ в 0.2% по HCl. После добавления раствора №4 образцы колориметрируют в предварительно калиброваных кварцевых кюветах. Можно производить определение фитина в одной кювете для избегания разброса данных. В качестве контроля используют смесь растворов №3 и №4 в тех же пропорциях, что и для образцов, заменяя объем пробы равным объемом воды. Содержание фитина рассчитывают по заранее составленному градуировочному графику, используя в качестве стандарта водный раствор натриевой соли фитиновой кислоты (Sigma). По кривой зависимости величины оптической плотности при 337 нм от количества фитината натрия в образце видно, что линейная зависимость наблюдается при концентрации фитина 0.08-4 мг/г с.м. При больших концентрациях фитина необходимо производить разведение образцов, а при концентрациях меньше 0.08 мг/г с.м. результаты недостоверны. Снижение погрешности определения и сопоставимость данных нескольких определений достигается использованием свежих реактивов одной партии с чистотой не менее ЧДА.

Расчет абсолютной массы (мг) фитина в образце с учетом разбавления в ходе анализа проводили по формуле:

f=C_f*(M_n+2000)*1,275/M_n,

где f - содержание фитина в пробе (мг); C_f - измеренная концентрация фитината (мг/мл); M_n - масса навески пробы (мг).

Расчет концентрации (в % масс.) фитина в образце с учетом разбавления в ходе анализа проводят по следующей формуле:

F=100f/M_n,

где F - содержание фитина в образце (%).

Необходимым замечанием является то, что примеси двух- и трехвалентных катионов металлов могут вносить погрешность в точность определения в связи с большим их сродством к фитиновой кислоте, нежели у катиона железа(III). В связи с этим необходимо следить за чистотой используемых реактивов (ч.д.а.), посуды и воды (дистиллят или бидистиллят).