Применение сульфасалазина в качестве ингибитора образования конечных продуктов гликирования

Изобретение относится к применению лекарственного препарата Сульфасалазина (международное непатентованное название) (синонимы: Cалазосульфапиридин, Azopyrine, Asulfidine, Salazopyridin, Salazopyrin, Salazosulfapyridine, Salicylazosulfapyridin, Salisulf, Sulfasalazyn, Sulphasalazine) общей формулы I по новому назначению в качестве ингибитора образования конечных продуктов гликирования (далее КПГ):

Сульфасалазин I является эффективным ингибитором образования конечных продуктов гликирования и может найти широкое применение в медицине в области лечения социально-значимых заболеваний, а именно - осложнения сахарного диабета, атеросклероз, ревматоидный артрит, остеоартрит, нейродегенеративные заболевания, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона, катаракта, заболевания, связанные со старением, и другие.

Из исследованного заявителем уровня техники выявлено, что Сульфасалазин был выведен на рынок в 1950-х годах в качестве средства для лечения ревматоидного артрита, болезни Крона и неспецифического язвенного колита ([1] M.A. Peppercorn, Ann. Intern. Med., 1984, 101: 377-386; [2] G.L. Plosker, K.F. Croom, Drugs, 2005, 65: 1825-1849). Механизм действия Сульфасалазина и его метаболитов связан, в первую очередь, с ингибированием активации семейства – ядерного фактора kappa B (NFKB), который содержится в клетках всех типов и связан с развитием воспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также септического шока. Сульфасалазин способен накапливаться в соединительной ткани кишечника с высвобождением 5-аминосалициловой кислоты, обладающей противовоспалительной активностью, и сульфапиридина, оказывающего противомикробное действие в отношении диплококков, стрептококков, гонококков, кишечной палочки.

Однако анализ литературных и патентных источников не выявил информации об антигликирующей активности Сульфасалазина. Таким образом, проведенный заявителем анализ уровня техники не выявил данных о возможности применения Сульфасалазина (формула I) и его солевых и сокристальных форм в качестве ингибиторов образования конечных продуктов гликирования.

Гликирование (неферментативное гликозилирование, реакция Майяра) – это химическая реакция, в которой карбонильные группы восстановленных сахаров связываются с аминогруппами долгоживущих белков, липидов или пептидов, с образованием конечных продуктов гликирования (КПГ) ([3] S. Khangholi, F.A. Abdul Majid, N.J.A. Berwary, F. Ahmad, R. Bin Abd Aziz, Planta Med., 2016; 82: 32–45; [4] V.P. Singh, A. Bali, N. Singh, A.S. Jaggi, Korean J. Physiol. Pharmacol., 2014, 18: 1-14).

При этом внутри- и внеклеточное накопление КПГ считают важным фактором патогенеза таких заболеваний, как атеросклероз ([5] М. Busch, S. Franke, C. Rüster, G. Wolf, European Journal of Clinical Investigation, 2010, 40(8): 742-755), сердечная недостаточность, воспаление, ревматоидный артрит и остеоартрит, нейродегенеративные заболевания, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона ([6] J. Li, D. Liu, L. Sun, Y. Lu, Z. Zhang, Journal of the Neurological Sciences, 2012, 317: 1–5), прочие болезни, связанные со старением, катаракта ([7] I. Sadowska-Bartosz I,G. Bartosz, Mech. Ageing Dev. 2016, 160: 1-18).

Весьма интенсивно данный процесс протекает при сахарном диабете, при этом скорость образования КПГ зависит от концентрации и длительности действия глюкозы ([8] R. Ramasamy, S.F. Yan, A.M. Schmidt, Ann. N. Y. Acad Sci., 2011, 1243: 88-102; [9] М.И. Балаболкин, Сахарный Диабет, 2002, 4: 8-16).

Эффекты КПГ могут быть классифицированы как рецептор-независимые или рецептор-зависимые, и КПГ могут действовать внутриклеточно или циркулировать и действовать на рецепторы клеточной поверхности, такие как рецептор для КПГ (РКПГ). Поскольку гликирование происходит в течение длительного периода времени, КПГ влияют на долгоживущие белки. Например, главными мишенями для них являются структурные компоненты соединительной ткани и, в частности, коллаген типа IV, а также другие долгоживущие белки, в том числе миелин, тубулин, кристаллин, активатор плазминогена 1, фибриноген, которые могут также подвергаться гликированию ([10] S.-Y. Goh, M. E. Cooper. J Clin Endocrinol Metab, 2008, 93(4): 1143–1152).

Связываясь c мембранными РКПГ, конечные продукты гликирования активируют некоторые внутриклеточные сигнальные пути, приводящие к увеличению образования провоспалительных цитокинов, свободных радикалов и хемоаттрактантов ([3]; [11] S.C. Ho, P.W. Chang, Am. J. Plant. Sci., 2012, 3: 995–1002).

Все вышеперечисленное лежит в основе патогенеза таких последствий сахарного диабета, как диабетические атеросклероз, нефро-, нейро-, ретино-, кардио-, ангиопатии, которые являются причиной высокого риска инвалидизации и смертности среди пациентов с сахарным диабетом.

Применение соединений, обладающих высокой антигликирующей активностью, позволит уменьшить образование КПГ в организме, тем самым улучшая качество жизни пациентов, снижая риск возникновения атеросклероза, катаракты, ревматоидного артрита, остеоартрита, нейродегенеративных заболеваний, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона, а также таких осложнений сахарного диабета, как диабетические атеросклероз, нефро-, нейро-, ретино-, кардио-, ангиопатии, которые являются причиной высокого риска инвалидизации и смертности среди пациентов с сахарным диабетом.

Все вышеперечисленное обусловливает повышенный интерес в мире к поиску ингибиторов образования конечных продуктов гликирования, поскольку препаратов, специфически угнетающих образование КПГ и разрешенных для клинического применения, в мире на дату представления настоящей заявки заявителем не выявлено.

Проведенный заявителем анализ российских и зарубежных патентных баз данных, научной литературы и Интернет-ресурсов показал, что существуют аналоги заявленного технического решения по назначению, способные ингибировать образование КПГ, которые, однако, обладают значительными недостатками, а именно - недостаточно высокой эффективностью и/или существенными побочными эффектами, например, обладают высокой токсичностью и т.д.

Далее заявителем приведена информация о выявленных препаратах, вышедших на стадию клинических испытаний.

Первым и наиболее изученным веществом, ингибирующим гликирование белков, является аминогуанидин (АГ) ([12] A. Cerami, P.C. Ulrich, M. Brownlee, Pat US4758583A, опубл. 19.07.1988). Он предназначен для предотвращения формирования КПГ и глюкозопроизводных поперечносшитых молекул коллагена. Механизм антигликирующего действия аминогуанидина связывают с его способностью захватывать реактивные дикарбонильные интермедиаты. Однако клинические испытания данного препарата были остановлены в связи с его недостаточной эффективностью и наличием побочных эффектов, в связи с чем препарат был снят с клинических испытаний.

В настоящее время проводятся клинические испытания пиридоксамина ([13] R. Khalifah, B.G. Hudson, Pat US6716858B1, опубл. 06.04.2004), также обладающего антигликирующими свойствами, но он тоже проявляет невысокую активность, сопоставимую с аминогуанидином, который снят с клинических испытаний. Других аналогов заявленного технического решения, используемых по назначению и вошедших на стадию клинических исследований, на дату предоставления настоящей заявки заявителем не выявлено.

Таким образом, на дату представления заявочных материалов проблема создания высокоактивных ингибиторов образования КПГ, разрешенных к клиническому применению, остается нерешенной не только в РФ, но и за рубежом.

Задачей заявленного технического решения является использование сульфасалазина в качестве ингибитора КПГ, что обеспечивает возможность вывода на рынок новых лекарственных средств, не имеющих аналогов в мире.

Техническим результатом предполагаемого изобретения является применение по новому назначению в качестве ингибитора образования КПГ сульфасалазина (известного на дату подачи настоящей заявки как средство, используемое для лечения ревматоидного артрита, болезни Крона и неспецифического язвенного колита), обладающего более высокой антигликирующей активностью по сравнению с известными веществами, вышедшими на стадию клинических исследований.

Сущностью предполагаемого изобретения является применение Сульфасалазина (синонимы: Cалазосульфапиридин, Azopyrine, Asulfidine, Salazopyridin, Salazopyrin, Salazosulfapyridine, Salicylazosulfapyridin, Salisulf, Sulfasalazyn, Sulphasalazine) формулы I в качестве ингибитора образования конечных продуктов гликирования.

Заявленное техническое решение иллюстрируют следующие материалы:

- Таблица 1, в которой представлена антигликирующая активность сульфасалазина и препарата сравнения аминогуанидина.

- Таблица 2, в которой представлены значения 50%-ой ингибирующей концентрации сульфасалазина и препарата сравнения аминогуанидина.

Ниже приведен пример конкретного выполнения заявленного технического решения.

Пример. Определение антигликирующей активности.

Реакцию гликирования воспроизводят по методу А. Jedsadayanmata ([14] A. Jedsadayanmata, Naresuan University Journal, 2005, 13(2): 35-41).

Реакционная смесь содержит растворы бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и глюкозы (500 мМ) в фосфатном буфере (pH = 7.4). Для предупреждения бактериального роста в буферный раствор вносят азид натрия в конечной концентрации 0.02%. Все вещества растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО).

В экспериментальные образцы добавляют 30 мкл раствора сульфасалазина в различных концентрациях, в контрольные образцы добавляют ДМСО в аналогичном объеме.

Все экспериментальные образцы инкубируют в течение 24 часов при 60 °С.

По истечении срока инкубации проводят определение специфической флуоресценции гликированного бычьего сывороточного альбумина (БСА) на спектрофлуориметре F-7000 (Hitachi, Япония) при длине волны возбуждения 370 нм и испускания 440 нм.

В качестве вещества сравнения используют известный ингибитор гликирования аминогуанидин (Таблица 1) ([15] P.J. Thornalley, Archives of Biochemistry and Biophysics, 2003, 419: 31–40).

Статистическую обработку результатов проводят с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, табличного редактора Microsoft Excel 2007 и программы GraphPad Prism 5.0.

Расчет показателя IС₅₀ проводят методом регрессионного анализа (Таблица 2) (IC₅₀ - концентрация полумаксимального ингибирования, является количественным индикатором, который показывает, сколько нужно ингибитора для ингибирования биологического процесса на 50 %).

Примечание: *данные достоверны по отношению к положительному контролю (критерий Манна-Уитни, p<0,05).

Анализ данных, приведенных в Таблице 1, показывает, что при использовании сульфасалазина концентрация КПГ меньше примерно в 2-12 раз (в зависимости от исходной концентрации препаратов), чем при использовании аминогуанидина, что является неоспоримым доказательством возможности применения сульфасалазина в качестве ингибитора образования конечных продуктов гликирования.

В Таблице 2 приведены значения показателя IC₅₀  сульфасалазина по сравнению с аминогуанидином.

Таблица 2.

Значения IC₅₀ гликирования БСА

Из данных, приведенных в Таблице 2, видно, что что сульфасалазин проявляет высокий уровень антигликирующей активности, а именно - применение сульфасалазина в качестве ингибитора КПГ эффективнее применения аминогуанидина более чем в 8 раз.

Таким образом, из вышеизложенного можно сделать вывод, что заявителем решены поставленные задачи и достигнут заявленный технический результат, а именно – доказана возможность применения известного препарата сульфасалазина по новому назначению – в качестве эффективного ингибитора образования конечных продуктов гликирования.

Полученные заявителем результаты свидетельствуют о том, что сульфасалазин существенно превосходит по активности аминогуанидин, что позволяет рассматривать его (сульфасалазин) в качестве эффективного ингибитора образования конечных продуктов гликирования. При этом в отличие от аминогуанидина, сульфасалазин является разрешенным к применению лекарственным средством, доказавшим свою высокую эффективность и безопасность в ходе многолетних исследований и клинического применения.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что заявленное техническое решение позволяет создать новые высокоэффективные и безопасные лекарственные средства для профилактики и лечения микро- и макрососудистых осложнений сахарного диабета, атеросклероза, нейродегенеративных заболеваний, катаракты, заболеваний, связанных со старением, тем самым улучшая качество жизни пациентов.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью отличительных признаков, обеспечивающих достижение заявленных результатов.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалиста в данной области науки и техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», т.к. может быть реализовано на любом специализированном предприятии с использованием стандартного оборудования, известных отечественных материалов и технологий.