Результат интеллектуальной деятельности: БЕЗЫНСТРУМЕНТАЛЬНЫЙ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии, и касается разработки иммунологической видоспецифической системы для диагностики псевдотуберкулеза.

Псевдотуберкулез - инфекционное заболевание, вызываемое Yersinia pseudotuberculosis, передающееся алиментарным путем и характеризующееся полиморфизмом клинических проявлений. Полиморфность клинических признаков псевдотуберкулеза, его широкое распространение и неблагоприятные последствия диктуют необходимость совершенствовать диагностику этого острого инфекционного заболевания, относящегося к сапронозам.

На территории Российской Федерации ежегодно регистрируются групповые случаи псевдотуберкулеза, возникающие в детских дошкольных учреждениях, школах, интернатах, в загородных детских коллективах, воинских частях, на предприятиях или в учебных заведениях, объединенных единым источником питания.

Официальные показатели заболеваемости в РФ псевдотуберкулеза за последние годы (7,1-7,3 на 100 тыс. населения) не отражают истинного уровня распространения инфекции вследствие неравномерности распространения заболеваемости, сезонности инфекции и отсутствия достаточного количества диагностикумов, обладающих достаточными уровнями чувствительности и специфичности на разных стадиях заболевания.

Таким образом, актуальность изучения и диагностики этой инфекции сохраняется, а совершенствование диагностической базы позволит более адекватно оценивать уровень заболеваемости, экологические особенности возбудителя псевдотуберкулеза и, соответственно, реализовать более действенные меры эпидемического контроля.

Известен способ безынструментальной диагностики псевдотуберкулеза (Инструкция по применению диагностикума эритроцитарного псевдотуберкулезного антигенного для РНГА, утв. приказом Росздравнадзора от 12.10.2007 г.). В основе его конструирования лежит сенсибилизация специфическим полисахаридным антигеном возбудителя псевдотуберкулеза I сероварианта эритроцитов барана, которые при наличии в исследуемой сыворотке специфических антител к Yersinia pseudotuberculosis агглютинируют через 1,5-2 часа инкубации при температуре 37°С и 14-18 часов при температуре 18-22°С (положительный результат). При отрицательном результате агглютинация отсутствует. Постановка реакции проводится в U-образных лунках полистирольного планшета.

Основным и существенным недостатком этого способа является его типовая специфичность (способность выявлять антитела только к возбудителю псевдотуберкулеза I сероварианта), что существенно ограничивает его диагностическую ценность в тех случаях, когда заболевание вызвано Yersinia pseudotuberculosis других серовариантов (II-VIII). Кроме того, результат реакции учитывается только на следующий день после постановки, что увеличивает диагностический период, а следовательно, отодвигает начало этиотропного лечения пациентов.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ, описанный в автореферате докторской диссертации Раева М.Б. «Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц», Санкт-Петербург, 2008. Способ включает прямое определение IgG, при этом на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм наносят IgG, после подсушивания мембраны и 30-минутной инкубации в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами раствор, затем мембрану инкубировали в течении 15 минут в растворе конъюгата G-белок-углерод.

Недостатком прототипа является то, что данным способом осуществляют диагностику только ВИЧ-инфекций.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является получение видоспецифической диагностической системы для выявления антител к Yersinia pseudotuberculosis с более высокими чувствительностью, наглядностью, надежностью, простотой и оперативностью.

Это достигается тем, что в безынструментальном способе диагностики псевдотуберкулеза, включающем прямое определение специфических антител в сыворотке крови больного путем нанесения на нитроцеллюлозную мембрану антигена, подсушивания ее, инкубации сначала в блокирующем растворе, а затем в растворе конъюгата с G-белок-углерод, согласно изобретению инкубацию осуществляют в течение 1 часа, блокирующий раствор дополнительно содержит 0,05% твин-20 и 1% казеина, а качестве антигена используют комплекс белков Yersinia pseudotuberculosis.

Новизна данного способа заключается в следующем:

- инкубацию осуществляют в течение 1 часа;

- блокирующий раствор дополнительно содержит 0,05% твин-20 и 1% казеина;

- в качестве сенситина используют комплекс белков Yersinia pseudotuberculosis, что позволяет определять не только антитела к возбудителю псевдотуберкулеза I сероварианта, но и других серовариантов (II-VIII). Это значительно расширяет диагностический диапазон предлагаемого способа диагностики.

Заявляемое техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», так как неизвестно использование комплекса белков Yersinia pseudotuberculosis, в состав которых не входит порин, в качестве сенситина.

Визуализацию специфического комплекса анти-аналит-аналит осуществляют конъюгатом G-белок-углерод в течение 15 минут.

Это значительно увеличивает чувствительность системы определения антител предлагаемым способом. Так, в стандартной псевдотуберкулезной сыворотке предел разведения 1:16000-1:32000, что в 1,5-2 раза выше титра специфической активности прототипа.

Способ осуществляется следующим образом. В качестве твердой фазы используется мембрана из нитроцеллюлозы с диаметром пор 0,45 мкм (Bio-Rad, США).

На диски из нитроцеллюлозной мембраны диаметром 5 мм наносили сенситин (комплекс белков Yersinia pseudotuberculosis) по 5 мкл в концентрации 0,005 мг/мл в забуференном фосфатами физиологическом растворе с азидом натрия (ЗФР-NaN₃). В качестве внутреннего отрицательного контроля сорбировали бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 0,05 мг/мл.

После подсушивания мембраны и инкубации (1 час) в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами физиологический раствор, содержащий 0,05% твина-20 и 1% казеина (ЗФРТК), мембраны помещали в лунки планшета, заполненные сывороткой с антителами к возбудителю псевдотуберкулеза с серийным разведением, кратным двум, начиная с разведения 1:500. В качестве внешнего отрицательного контроля аналогично подготовленные мембраны твердофазного реагента вносили в лунки с сывороткой здорового мужчины с серийным разведением пробы, кратным двум, начиная с разведения 1/500. Время инкубации составляло 30 минут, после чего мембраны промывали ЗФРТ и осуществляли детекцию конъюгатом G белок-углерод в течение 15 минут. Конъюгат G белок-углерод готовили по оригинальному способу (Раев М.Б. Частицы коллоидного углерода в качестве меток диагностических реагентов // Вестник уральской медицинской академической науки. 2006. №3(1). С.202-205). В качестве источника частиц углерода использовали аморфный углерод, который получали в виде сажи путем конденсирования из пламени горящего толуола на стеклянной поверхности. Собранный материал подвергали тщательной отмывке комплексом органических растворителей до исчерпывающего удаления продуктов неполного окисления углеводорода. Углерод суспендировали в 10-кратном по весу количестве толуола и кипятили в колбе с обратным холодильником в течение 30 минут, остужали, отфильтровывали на фильтре Шотта. Посредством высушивания под вакуумом конечный продукт освобождали от следов связанных органических растворителей и дополнительно прокаливали до постоянного веса в сухожаровом шкафу при 200-300°С в течение 12-24 часов. Получаемый подобным способом чистый аморфный углерод представлял собой матово-черный лиофильный порошок, нерастворимый в доступных известных растворителях.

В процессе получения суспензии углеродных частиц к 2-процентному раствору белка G в ЗФР добавляли аморфный углерод до конечной концентрации 5% в условиях вихревого перемешивания на магнитной мешалке. Использовали магнитный перемешивающий элемент, выполненный в виде «турбинки», что обеспечивало дополнительную гомогенизацию получаемой суспензии. Время, необходимое для полной пептизации частиц при комнатной температуре, составляло 30-36 часов. Полученную суспензию озвучивали в ультразвуковом дезинтеграторе. Условия ультразвуковой обработки суспензии (частота и мощность, количество и продолжительность циклов озвучивания) подбирали таким образом, чтобы обрабатываемый материал при одновременном (возможном) охлаждении не разогревался до температуры свыше 40°С. Полученный в результате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензоид центрифугировали при 6000 g в течение 5 минут с целью удаления оставшихся относительно крупных частиц. В суспензию пептизированных белком G частиц углерода на роторном встряхивателе вносили равный объем 25% глутарового альдегида. Процесс конъюгирования проводили в течение 1 часа 40 минут при комнатной температуре и интенсивном перемешивании, после чего реагент центрифугировали при 6000 g и освобождали от избытка глутарового альдегида и несвязавшегося анти-лиганда гель-фильтрацией на колонке с Сефарозой CL-6B.

Пример 1

Твердофазный реагент аналитической системы готовили следующим образом. На диски из нитроцеллюлозной мембраны диаметром 5 мм наносили антиген (комплекс белков Yersinia pseudotuberculosis) по 5 мкл в концентрации 0,005 мг/мл в забуференном фосфатами физиологическом растворе с азидом натрия (ЗФР-NaN₃). В качестве внутреннего отрицательного контроля сорбировали бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 0,05 мг/мл.

После подсушивания мембраны и инкубации (1 час) в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами физиологический раствор, содержащий 0,05% твина-20 и 1% казеина (ЗФРТК), мембраны помещали в лунки планшета, заполненные сывороткой с антителами к возбудителю псевдотуберкулеза с серийным разведением, кратным двум, начиная с разведения 1:500. В качестве внешнего отрицательного контроля аналогично подготовленные мембраны твердофазного реагента вносили в лунки с сывороткой здорового мужчины с серийным разведением пробы, кратным двум, начиная с разведения 1:500. Время инкубации составляло 30 минут, после чего мембраны промывали ЗФРТ и осуществляли визуальную (безынструментальную) детекцию конъюгатом G белок-углерод в течение 15 минут.

Результаты эксперимента представлены на рис.1.

Как видно из результатов эксперимента, чувствительность системы определения антител в стандартной псевдотуберкулезной сыворотке находится в пределах разведения 1:16000-1:32000, что в 1,5-2 раза выше титра специфической активности прототипа. Отсутствие ложноположительных результатов во внешних и внутренних отрицательных контролях говорит о хорошей специфичности созданной системы. Получение конечного результата происходит через 2 часа, что намного быстрее, чем в прототипе.

Пример 2. На диски из нитроцеллюлозной мембраны с размером пор 0,45 мкм и диаметром 5 мм наносили антиген (комплекс белков Yersinia pseudotuberculosis) по 5 мкл в концентрации 0,001 мг/мл в ЗФР-N₃. В качестве внутреннего отрицательного контроля наносили фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР). После подсушивания мембраны и инкубации (1 час) в блокирующем растворе ЗФРТК мембраны помещали в лунки планшета, заполненные различными сыворотками, содержащими антитела к токсинам псевдотуберкулеза, эшерихиоза, сальмонеллеза, иерсиниоза, с серийным разведением, кратным двум, начиная с разведения 1:500. Учитывая, что возбудители псевдотуберкулеза, иерсиниоза, эшерихиоза и сальмонеллеза относятся к одному семейству этеробактерий (Enterobacteriaceae), но к разным родам, кроме псевдотуберкулеза и иерсиниоза, в эксперименте оценивали перекрестные реакции антигена Yersinia pseudotuberculosis с вышеуказанными сыворотками. В качестве внешнего отрицательного контроля аналогично подготовленные мембраны твердофазного реагента вносили в лунки с сывороткой здорового мужчины в разведении 1:200 и ФСБР. Время инкубации составляло 30 минут, после чего мембраны промывали ЗФРТ и осуществляли визуальную (безприборную) детекцию конъюгатом G-белок-углерод в течение 15 минут.

Результаты эксперимента представлены на рис.2.

Последовательность операций:

1. Сорбция антигена Yersinia pseudotuberculosis в концентрации 10 мкг/мл.

2. Блокирование забуференным фосфатами физиологическим раствором, содержащим 0,05% твина-20 и 1% казеина (ЗФРТК).

3. Инкубация с сыворотками.

4. Визуальная (безынструментальная) детекция конъюгатом углерод-G-белок.

На рис.2 видно, что чувствительность системы определения специфических антител в псевдотуберкулезной сыворотке: 1:32000-1:64000. С сыворотками, содержащими антитела к другим представителям семейства Enterobacteriaceae, в том числе к Yersinia enterocolitica, положительных реакций не выявлено. Следовательно, сконструированный диагностикум является видоспецифическим. Получение конечного результата происходит через 2 часа, что значительно быстрее, чем в прототипе.

Нитроцеллюлозную мембрану с результатами реакции можно хранить в высушенном виде в течение нескольких месяцев (например, в карточке больного, картотеке врача, истории болезни и т.д.).

Таким образом, предложенный способ позволяет улучшить и сократить по времени диагностику псевдотуберкулеза, так как чувствительность системы определения специфических антител в псевдотуберкулезной сыворотке составляет 1:32000-1:64000. Технический результат от использования изобретения заключается в повышении диагностической эффективности при сохранении высокой чувствительности и видоспецифичности способа, сокращении времени на проведение исследования, визуальной (безынструментальной) детекции результатов исследования и возможности сохранения (документирования) результата исследования в течение длительного времени.

Заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленное применение», так как применяемые реагенты доступны, а исследования легко выполняемы.