Результат интеллектуальной деятельности: ЗАЩИТНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ НЕЙРОНА СЕТЧАТКИ, СОДЕРЖАЩЕЕ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО КОМПОНЕНТА ПРОИЗВОДНОЕ ПРОСТАГЛАНДИНА F2α

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к защитному средству для нейронов сетчатки, содержащему в качестве активного компонента производное простагландина F2α.

Уровень техники

Сетчатка - это ткань, толщиной от 0,1 до 0,5 мм, состоящая из десяти слоев: внутренней пограничной мембраны, слоя нервных волокон, слоя ганглионарных клеток, внутреннего сетчатого слоя, внутреннего ядерного слоя, внешнего сетчатого слоя, внешнего ядерного слоя, внешней пограничной мембраны, слоя фоторецепторных клеток и слоя пигментного эпителия сетчатки, а также из групп нейронов сетчатки, включающих фоторецепторные клетки, биполярные нейроны, ганглионарные клетки, горизонтальные нейроны, амакринные нейроны и клетки Мюллера.

Нейроны сетчатки играют важную роль в получении и передаче зрительной информации, такой как превращение светового раздражения в электрический сигнал и передаче сигнала в мозг.

В более точном описании механизма такой передачи, зрительная информация от глаз преобразуется в электрический сигнал с помощью фоторецепторных клеток и передается ганглиоцитам через горизонтальные нейроны, биполярные нейроны и/или амакринные нейроны. Таким образом, электрический сигнал передается мозгу с помощью зрительного нерва, который представляет собой пучок нервных волокон, включающий в себя аксоны ганглионарных клеток.

С другой стороны, когда эти нейроны сетчатки повреждаются в результате различных причин, гомеостаз (функция доставки кислорода или питательных веществ к нейронам сетчатки посредством кровообращения в сетчатке и тому подобное) нейронов сетчатки не может поддерживаться, и передача зрительной информации к мозгу подавляется. Например, широко известно, что нарушение функций нейронов сетчатки вызывается различными заболеваниями сетчатки, такими как окклюзия сосудов сетчатки, диабетическая ретинопатия, ишемическая зрительная нейропатия, глаукома, макулярная дегенерация, пигментная дегенерация сетчатки и болезнь Лебера (Brain Res. Bull., 62(6), 447-453 (2004)).

Недавно пришли к заключению, что гибель нейрона сетчатки, связанная с ретинальной ишемией, является одной из причин повреждения нейронов сетчатки, и сообщалось, что в связи с ишемией сетчатки, приводящей к гибели нейронов сетчатки, происходят следующие события (JP-A-2003-146904 и Nature Rev., 2,448-459 (2003)):

1) механизм гибели нейрона сетчатки, связанной с ишемией сетчатки, сходен с механизмом гибели нейронов головного мозга, связанной с ишемией головного мозга;

2) при кратковременной ишемии сетчатки избирательно повреждается внутренний слой сетчатки (внутренний сетчатый слой);

3) при ишемии сетчатки наблюдается избыточное освобождение глутамата;

4) введением возбуждающих аминокислот, таких как глутамат, в стекловидное тело индуцирует гибель нейронов сетчатки;

5) гиперстимуляция, опосредуемая ретинальными рецепторами М-метил-D-аспартата (NMDA), стимулирует вход кальция (Са) в клетки, что приводит к индукции клеточного повреждения в результате индукции монооксида азота (NO).

На основании этих фактов было сделано заключение, что такие лекарства, как ингибитор нейротоксичности глутамата, антагонист NMDA-рецептора или ингибитор синтеза NO, полезны для лечения глазных заболеваний, вызываемых повреждением нейронов сетчатки, и было проведено множество исследований.

Например, документ JP-A-2001-072591 раскрывает защитное средство для нейрона сетчатки, содержащее в качестве активного компонента нипрадилол, который является одним из β-блокаторов. Публикация WO 01/056606 раскрывает защитное средство для клетки зрительного ганглия, содержащее в качестве активного компонента белок антагонист рецептора интерлейкина-1. WO 03/004058 раскрывает защитное средство для клетки зрительного ганглия, содержащее в качестве активного компонента антагонист α₁ рецептора, такой как бримонидин гидрохлорид. Experimental Eye Res., 72, 479-486 (2001) раскрывает защищающий нервные клетки эффект латанопроста, который является одним из производных простагландина, и так далее.

С другой стороны, в документах JP-A-59-1418, JP-T-3-501025, JP-T-8-501310, JP-A-10-182465, WO 98/12175, European Patent Application Publication No. 850926, JP-A-2004-002462, JP-A-10-259179, JP-A-2002-293771 и JP-A-2003-321442 в качестве терапевтических соединений для глаукомы с пониженным внутриглазным давлением были раскрыты производные простагландина F2α. JP-A-59-1418 раскрывает природное производное простагландина F2α. JP-T-3-501025 раскрывает латанопростподобное соединение. JP-T-8-501310 раскрывает биматопростподобное соединение. JP-A-10-182465 раскрывает травопростподобное соединение. WO 98/12175 раскрывает монофторпроизводное простагландина F2α. European Patent Application Publication No. 850926 и JP-A-2004-002462 раскрывает дифторпроизводное простагландина F2α. JP-A-10-259179 раскрывают фторсодержащее производное простагландина F2α, имеющее полизамещенные арилоксигруппы. JP-A-2002-293771 раскрывает дифторпроизводное простагландина F2α в виде эфира. JP-A-2003-321442 раскрывает амид дифторпроизводного простагландина F2α.

Однако ни один из этих документов совсем не описывает защитный эффект фторсодержащего производного простагландина F2α для нейронов сетчатки.

Раскрытие изобретения

Задачи, которые должны быть решены

Представляет большой интерес обнаружить новое фармакологическое применение производного простагландина F2α (в частности фторсодержащего простагландина F2α).

Способы решения задач

Таким образом, авторы настоящего изобретения проводили интенсивные исследования с целью найти новое фармацевтическое приложение производного простагландина F2α. В результате этих исследований, в опытах на нейронах сетчатки эмбрионов крысы они обнаружили, что производное простагландина F2α ингибирует зависимым от концентрации образом индуцируемую глутаматом гибель нейронов сетчатки, другими словами, действие производного простагландина F2α направлено непосредственно на нейроны сетчатки и проявляет защитный эффект, и таким образом совершили настоящее изобретение.

Настоящее изобретение имеет отношение к защитному средству для нейрона сетчатки, содержащему в качестве активного компонента производное простагландина F2α.

Дополнительно, настоящее изобретение имеет отношение к способу защиты нейронов сетчатки и способу предотвращения или лечения заболевания глаза, связанного с повреждением нейронов сетчатки.

В настоящем изобретении термин «производное простагландина F2α» означает родственное простагландину F2α соединение, полученное на основе углеродного скелета простаноевой кислоты.

А именно защитным средством для нейрона сетчатки является, например, такое средство, которое содержит в качестве активного компонента производное простагландина F2α или его соль, такое как натуральное производное простагландина F2α, раскрытое в JP-A-59-1418, латанопростподобное соединение (при условии, что латанопростподобное соединение или его соль исключают латанопрост), раскрытое в JP-Т-3-501025, биматопростподобное соединение (предпочтительно биматопрост или его соль), раскрытое в JP-T-8-501310, травопростподобное соединение (предпочтительно травопрост или его соль), раскрытое в JP-A-10-182465, или фторсодержащее производное простагландина F2α; раскрытое в WO 98/12175, WO 98/12175, European Patent Application Publication No. 850926, JP-A-2004-002462, JP-A-10-259179, JP-A-2002-293771 или в JP-А-2003-321442.

Предпочтительно, защитным средством для нейрона сетчатки является, например, такое средство, которое содержит «фторсодержащее производное простагландина F2α» в качестве активного компонента. Термин «фторсодержащее производное простагландина F2α» означает производное простагландина F2α, имеющее один или более атомов фтора.

А именно защитным средством для нейрона сетчатки является, например, такое средство, которое содержит фторсодержащее производное простагландина F2α, раскрытое в качестве активного компонента в WO 98/12175, European Patent Application Publication No. 850926, JP-A-2004-002462, JP-A-10-259179, JP-A-2002-293771 или JP-A-2003-321442.

Более предпочтительно, защитным средством для нейрона сетчатки является, например, такое средство, которое содержит 15,15-дифторпроизводное простагландина F2α; раскрытое в качестве активного компонента в European Patent Application Publication No. 850926, JP-A-2004-002462, JP-A-10-259179, JP-A-2002-293771 или JP-A-2003-321442.

Дополнительно, более предпочтительным защитным средством для нейронов сетчатки является, например, такое средство, которое в качестве активного компонента содержит 15,15-дифторпроизводное простагландина F2α, имеющее следующую общую формулу (1), которое является дополнительно более предпочтительным фторсодержащим производным простагландина F2α или его соли.

[R означает гидроксиалкильную группу, формальную группу, карбоксильную группу, алкоксикарбонильную группу, арилоксикарбонильную группу, аминокарбонильную группу, алкиламинокарбонильную группу или ариламинокарбонильную группу, и если R является арилоксикарбонильной группой или ариламинокарбонильной группой, их арильная часть может иметь заместителя. То же самое относится и к дальнейшему в этом документе.]

Соответствующие группы и термины, определенные в этом описании изобретения, будут приведены ниже.

Термин «галоген» означает фтор, хлор, бром или йод.

Термин «алкил» означает алкил с прямой или разветвленной цепью, имеющей от 1 до 6 атомов углерода. Их специфические примеры включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил, изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил и им подобные.

Термин «алкокси» означает алкоксигруппы с прямой или разветвленной цепью, имеющей от 1 до 6 атомов углерода. Специфические примеры этих групп включают метокси, этокси, н-пропокси, н-бутокси, н-пентокси, н-гексилокси, изопропокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, изопентилокси и им подобные.

Термин «арил» означает моноциклический ароматический углеводород, или бициклический или трициклический конденсированный полициклический ароматический углеводород, имеющий от 6 до 14 атомов углерода. Специфические примеры этих соединений включают фенил, нафтил, антрил, фенантрил и им подобные.

Термин «арилокси» означает моноциклический ароматичесий углеводород, имеющий оксигруппу, или бициклический или трициклический конденсированный полициклический ароматический углеводород, имеющий оксигруппу, в состав которого входит от 6 до 14 атомов углерода. Специфические примеры этих групп включают фенокси, нафтилокси, антрилокси, фенантрилокси и им подобные.

Термин «алкиламино» означает моноалкиламиногруппу или диалкиламиногруппу, имеющую от 1 до 12 атомов углерода. Специфические примеры этих групп включают метиламиногруппу, этиламиногруппу, диметиламиногруппу, диэтиламиногруппу и им подобные.

Термин «ариламино» означает моноариламиногруппу или дириламиногруппу, имеющую от 6 до 28 атомов углерода. Специфические примеры этих групп включают фениламиногруппу, нафтиламиногруппу, метилфениламиногруппу, этилфенилиногруппу, дифениламиногруппу, диантриламиногруппу и им подобные.

В случае когда R является «арилоксикарбонильной группой» или «ариламинокарбонильной группой», арильная часть этой группы может иметь заместитель. В качестве заместителя предпочитают атом или группу, которые выбирают из атома галогена, алкильной группы, галогенированной алкильной группы и алкоксигруппы, и предпочтительно, чтобы число заместителей было от 1 до 3.

Дополнительным более предпочтительным фторсодержащим производным простагландина F2α является, например, 15,15-дифторпроизводное простагландина F2α, имеющее приведенную выше общую формулу (1), в которой R представлен карбоксигруппой или ее солью или алкоксикарбонильной группой.

Особенно предпочтительным фторсодержащим производным простагландина F2α является, например, 15,15-дифторпроизводное простагландина F2α, имеющее приведенную выше общую формулу (1), в которой R представлен карбоксигруппой, или ее солью, или изопропоксикарбонильной группой.

Дополнительно, другим предпочтительным соединением является, например, 15-монофторпроизводное простагландина F2α, описанное в вышеупомянутой публикации WO 98/12175.

Эти производные простагландина F2α могут быть в виде солей с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, азотная кислота, серная кислота или фосфорная кислота, в виде солей с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота или лимонная кислота, в виде солей со щелочными металлами, такими как литий, натрий или калий, в виде солей со щелочноземельными металлами, такими как кальций или магний, в виде солей аммония или им подобных. Эти соли также включены в настоящее изобретение.

В настоящем изобретении термин «нейрон сетчатки» означает нейрон, вовлеченный в передачу зрительного сигнала в мозг. А именно, это означает фоторецепторную клетку, горизонтальный нейрон, биполярный нейрон, зрительную ганглионарную клетку, амакринный нейрон и им подобные.

В настоящем изобретении термин «заболевание глаза» означает заболевание глаза, связанное с повреждением нейрона сетчатки.

А именно, это означает нарушение поля зрения, окклюзию сосудов сетчатки, диабетическую ретинопатию, ишемическую зрительную нейропатию, глаукому, макулярную дегенерацию, пигментную дегенерацию сетчатки и болезнь Лебера или им подобные заболевания и, предпочтительно, это означает нарушение поля зрения, окклюзию сосудов сетчатки, диабетическую ретинопатию, ишемическую зрительную нейропатию, глаукому, макулярную дегенерацию, пигментную дегенерацию сетчатки или болезнь Лебера.

Защитное средство для нейрона сетчатки настоящего изобретения может быть введено перорально или парентерально. Примеры лекарственных форм для введения включают глазные капли, глазную мазь, инъекцию, таблетку, капсулу, гранулу, порошок и им подобные, особенно предпочтительными являются глазные капли. Такой препарат может быть приготовлен с помощью любого из широко используемых способов, например, с помощью способа, раскрытого в документах JP-A-59-1418, JP-T-3-501025, JP-Т-8-501310, JP-A-10-182465, WO 98/12175, European Patent Application Publication No. 850926, JP-A-2004-002462, JP-A-10-259179, JP-A-2002-293771, JP-A-2003-321442, WO 02/22131 или им подобных.

Например, глазные капли могут быть приготовлены, при необходимости, с использованием вещества, поддерживающего тоничность раствора, такого как хлорид натрия или концентрированный глицерин, с использованием буфера, такого как фосфат натрия или ацетат натрия, с использованием поверхностно-активного вещества, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, полиоксил-40-стеарата или полиоксиэтилен гидрогенированного касторового масла, с использованием стабилизатора, такого как цитрат натрия или эдетат натрия, консерванта, такого как бензалконий хлорид или парабен. Допускается снижение pH раствора глазных капель в тех пределах, которые приемлемы для глазного лекарства. Предпочтительным уровнем pH является диапазон от 4 до 8.

Глазная мазь может быть приготовлена по необходимости с помощью широко применяемой основы, такой как белый мягкий парафин или жидкий парафин.

Дополнительно, препарат для приема внутрь, такой как таблетка, капсула, гранула или порошок, может быть по необходимости приготовлен с применением наполнителя, такого как лактоза, кристаллическая целлюлоза, крахмал или растительное масло, с применением смазывающего вещества, такого как стеарат магния или тальк, с применением связующего вещества, такого как гидроксипропилцеллюлоза или поливинилпирролидон, с применением дезинтегрирующего вещества, такого как карбоксиметилцеллюлоза в кальциевой форме или малозамещенная гидроксипропилметилцеллюлоза, с применением вещества для оболочки, такого как гидроксипропилметилцеллюлоза, макрогола или силиконовой смолы, с применением вещества, образующего пленку, такого как желатиновая пленка или ей подобная.

Доза может быть соответствующе подобрана в зависимости от симптомов, возраста, лекарственной формы и тому подобных условий. Глазные капли закапывают от одного до нескольких раз в день в концентрации от 0.00001 до 1% (w/v), предпочтительно от 0.0001 до 1% (w/v). Лекарственный препарат для перорального приема можно принимать однократно или его можно вводить в несколько приемов в дозе обычно от 0.01 до 5000 мг в день, предпочтительно от 0.1 до 1000 мг в день.

Преимущество изобретения

Как будет подробно описано ниже в разделе «Фармакологический тест», эффект производного простогландина F2α на индуцированную глутаматом гибель нейронов сетчатки исследовали на нейронах сетчатки зародышей крыс. В результате было показано, что производное простогландина F2α ингибирует индуцированную глутаматом гибель нейронов сетчатки зависимым от концентрации образом. То есть производное простогландина F2α защищает нейроны сетчатки и пригодно для профилактики или лечения заболеваний глаза, связанной с гибелью нейронов сетчатки.

Краткое описание чертежа

Чертеж - это график, показывающий коэффициент выживаемости для каждой концентрации в случае применения тестируемого соединения при добавлении глутамата.

Лучший способ осуществления изобретения

В дальнейшем в этом документе будут описаны примеры лекарственных препаратов настоящего изобретения и результаты фармакологического теста. Однако эти примеры описаны с целью лучшего понимания настоящего изобретения и не означают, что ими ограничивается объем настоящего изобретения.

[Примеры лекарственных препаратов]

В дальнейшем в этом документе согласно настоящему изобретению будут описаны примеры основных лекарственных препаратов, содержащих производное простагландина F2α.

1) Глазные капли (в 100 мл)

Желаемые глазные капли могут быть получены путем соответствующих изменений типов и количества производного простагландина F2α и добавок.

2) Глазная мазь (на 100 г)

Желаемая глазная мазь может быть получена путем соответствующих изменений типов и количества производного простагландина F2α и добавок.

[Фармакологический тест]

С целью найти новое фармакологическое приложение производного простагландина F2α на нейронах сетчатки эмбрионов крыс был оценен и изучен эффект производного простагландина F2α на защиту нейронов сетчатки от индуцированной глутаматом гибели нейронов сетчатки.

В этой связи, в качестве тестируемого компонента было применено производное простагландина F2α 16-фенокси-15-дезокси-15,15-дифтор-17,18,19,20-тетранор-простогландин F2α.

(1) Выделение культуры нейронов сетчатки

Беременную крысу SD подвергали лапаротомии под общим наркозом, матку переносили на чашку, содержавшую раствор сбалансированных солей Хенкса (HBSS). Из матки изолировали плод крысы, и извлекали глазные яблоки плода крысы. Сетчатку отделяли от глазных яблок под стереоскопическим микроскопом и разрезали на кусочки с помощью хирургического ножа. Затем сетчатку разрушали дальше, до клеточного уровня, и пропускали через нейлоновую сетку (No.305, производство NBC Industries Co., Ltd.) для удаления клеточных агрегатов, и затем полученный фильтрат центрифугировали при 1000 об/мин в течение 4 минут. Супернатант отбрасывали, а к оставшимся клеткам для суспендирования добавляли подходящее количество модифицированной среды Игла (MEM), содержавшей 10% сыворотки эмбриона теленка (FBS). После подсчета числа клеток с помощью гемоцитометра, к ним добавляли МЕМ-среду, содержавшую 10% FBS, и таким образом получали суспензию клеток с плотностью клеток равной 0.8×10⁶ клеток/мл. Клеточная суспензия была посеяна в количестве 80 мкл каждая на покрытые полиэтиленимином пластиковые диски, и эти диски оставляли в инкубаторе (37°С, 5% СО₂). День посева обозначали как 1-й день роста культуры, замену культуральной среды производили по четным дням. В этой связи, до 4-го дня применяли МЕМ-среду, содержавшую 10% FBS, и после 8-го дня применяли МЕМ-среду, содержавшую 10% сыворотки лошади (HS). В этой связи, на 6-й день, для удаления пролиферативных клеток применяли 6 мл среды, содержавшей цитарабин (Ara-С) (1.5×10^-5 М в МЕМ-среде, содержавшей 10% FBS).

(2) Приготовление HS-содержащей МЕМ-среды, содержащей тестируемое соединение

2 мг тестируемого соединения растворяли в 100%-ном этаноле, и полученный раствор был последовательно разведен HS-содержащей МЕМ-средой, таким способом была приготовлена HS-содержащая МЕМ-среда, содержащая тестируемое соединение в концентрации 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ или 100 нМ.

(3) Приготовление свободной от сыворотки МЕМ-среды, содержащей тестируемое соединение

2 мг тестируемого соединения растворяли в 100%-ном этаноле, полученный раствор был последовательно разведен свободной от сыворотки МЕМ-средой, таким способом была приготовлена свободная от сыворотки МЕМ-среда, содержащая тестируемое соединение в концентрации 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ или 100 нМ.

(4) Оценка гибели клеток

На 10-й день роста культуры пластиковые диски, на которые были посеяны и выращены клетки, переносили в HS-содержащую МЕМ-среду, содержащую тестируемое соединение, и инкубировали в течение 24 часов (37°С, 5%-ный СО₂). Пластиковые диски переносили в свободную от сыворотки МЕМ-среду, содержащую 1 мМ глутамат, и инкубировали в течение 10 минут, и затем переносили в свободную от сыворотки МЕМ-среду, содержащую тестируемое соединение, и инкубировали в течение 1 часа (37°С, 5%-ный СО₂). Затем, клетки красили 1,5%-ным трипановым синим в течение 10 минут и фиксировали добавлением туда 10%-ного формалинового фиксирующего раствора. После промывки клеток физиологическим солевым раствором окрашенные и неокрашенные клетки подсчитывали под инверсионным микроскопом.

В этой связи была подготовлена группа крыс, которым вводили растворитель, для проведения такого же теста, как был описан выше, за исключением того, что применяли HS-содержащую МЕМ-среду вместо вышеуказанной HS-содержащей МЕМ-среды, содержащей тестируемое соединение, и за исключением того, что применяли свободную от сыворотки МЕМ-среду вместо вышеуказанной свободной от сыворотки МЕМ-среды, содержащей тестируемое соединение.

Дополнительно была подготовлена группа крыс, не подвергавшаяся обработке, для проведения такого же теста, как был описан выше, за исключением того, что применяли HS-содержащей МЕМ-среду вместо вышеуказанной HS-содержащей МЕМ-среды, содержащей тестируемое соединение, и за исключением того, что применяли свободную от сыворотки МЕМ-среду вместо вышеуказанной свободной от сыворотки МЕМ-среды, содержащей тестируемое соединение, но затем обработку свободной от сыворотки МЕМ-средой, содержащей глутамат, не проводили.

Коэффициент выживаемости рассчитывали с помощью следующего уравнения для расчетов: коэффициент выживаемости (%) = {(число неокрашенных клеток) / (число неокрашенных клеток + число окрашенных клеток)} × 100

(5) Результаты и обсуждение

Как показано на чертеже, в группе крыс, которым вводили растворитель, наблюдали около 40% клеточной гибели нейронов сетчатки, связанной с обработкой глутаматом. Однако когда в качестве инкубационной среды применяли HS-содержащую МЕМ-среду, содержащую тестируемое соединение, то наблюдали зависимое от концентрации ингибирование индуцированной глутаматом гибели нейронов сетчатки и было подтверждено, что тестируемое соединение защищает нейроны сетчатки.