Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079

Область техники:

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, и может быть использовано для культивирования бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079, который составляет основу кормовой добавки «Энимспорин».

Определенный набор питательных веществ необходим микроорганизмам для проявления их полезных свойств [1]. Для получения полноценного питания (азотистые соединения, углеводы, микро- и макроэлементы, другие биологически активные вещества) необходимо, на основании индивидуальных особенностей микроорганизмов, проводить исследования по подбору состава питательных сред [2]. Для повышения биологической активности микроорганизмов в настоящее время все чаще используют дешевые питательные среды, на их основе разрабатывают более совершенные технологии с целью значительного повышения продуктивности бактериальных культур. В состав питательной среды входят различные компоненты, необходимые для развития микроорганизмов, в том числе и неорганические соединения - соли.

Неорганические соли используются в питательных средах как дополнительный источник N, Р, О, S, Н. Микроорганизмы лучше усваивают азот в восстановленной форме, остальные элементы - в окисленной форме.

Известна питательная среда [3] для культивирования Bacillus subtilis следующего состава (г/л):

фосфат калия однозамещенный - 0.2-0.4;

сульфат аммония - 1.0-3.0;

цитрат натрия - 1.0-3.0;

сернокислая медь - 0.001-0.01;

сернокислый цинк - 0.002-0.005;

сернокислое железо - 0.0001-0.001;

хлористый кальций - 0.09-0.2;

сернокислый магний - 0.1-0.5;

сернокислый марганец - 0.01-0.1;

пептон - 2.0-8.0;

мальтоза - 1.0-5.0;

вода - остальное.

Недостатком данной среды является многокомпонентность.

Известна аналогичная питательная среда [4] для культивирования Bacillus subtilis следующего состава (г/л):

1. Пептон - 12.0;

2. Дрожжевой экстракт - 5.0;

3. Натрий хлористый - 5.0;

4. Вода водопроводная до 1 л;

5. Канамицин - 50 мг/л;

6. Агар-Агар-20.0;

7. Вода водопроводная до 1 л.

Питательную среду формируют в емкости в виде слоя, на который укладывают полупроницаемую мембрану, например, целлофановую пленку. Сверху на пленку наносят посевную дозу штамма бактерий. Культивирование осуществляют в термостате при температуре 34-37°С в течение 20-24 ч. Далее емкость переносят в термостат с температурой 6-10°С и выдерживают при этой температуре в течение суток до образования спор бактерий.

Недостатком данной среды является то, что в состав среды входит канамицин - антибиотический препарат группы аминогликозидов. Для его приобретения требуется оформление разрешающих документов. Так же используется трудоемкая технология посева микроорганизмов.

Целью предлагаемого изобретения является создание питательной среды для увеличения количества бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079. Поставленная цель достигается тем, что в питательную среду, содержащую питательную основу и дистиллированную воду, вносится одна из неорганических солей - сульфат аммония.

Сущность технического решения поясняется следующим.

В качестве исходного штамма использовали штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-12079, который представляет собой светло-коричневый сухой порошок из лиофильно высушенных бактерий штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-12079. Содержание спор составляет 5×10⁹ КОЕ/г. Навеску спор взвешивали в стерильных условиях на аналитических весах, погрешность которых составляет 0.0002 г.

Описание изобретения

Из спор готовили суспензию: в колбу Эрленмейера объемом 50 мл, содержащую жидкую питательную среду, которую готовят при следующем соотношении компонентов (г/л): пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, неорганическая соль в различных количествах (см таблица 1), остальное - дистиллированная вода. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизация при 1,1 атм. в течение 40 мин.

Затем вносили 5 г спор. Микроорганизмы (штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-12079) выращивали в колбах с жидкой средой в шейкер-инкубаторе «Innova 44» при 250 об/мин (эксцентриситет 5 см) и температуре 37°С в течение 24 часов. Такие условия являются оптимальными для Bacillus subtilis. Для выявления численности микроорганизмов использовали стандартный метод десятикратных разведений, с высевом в стерильных условиях в чашки Петри на твердую питательную среду, которую готовили при следующем соотношении компонентов: пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, неорганическая соль в различных количествах (см таблица 1), агар - 18, остальное - дистиллированная вода. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизация при 1,1 атм. в течение 40 мин.

После чего чашки с посевами инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов. В качестве контрольной пробы проводилось культивирование на средах без добавления солей. Для достоверности все опыты были проведены в семикратной повторности. Для культивирования использовали питательные среды (табл. 1).

Для оптимизации питательной среды для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079, были выбраны следующие неорганические соли: сульфат аммония - (NH₄)₂SO₄; гидрофосфат аммония - (NH₄)₂HPO₄; дигидрофосфат аммония - NH₄H₂PO₄.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Влияние сульфата аммония.

Данные культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 на средах, содержащих различные концентрации сульфата аммония, представлены в таблице 2.

Из приведенных данных видно, что максимальный достоверный рост количества колоний Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 наблюдался в средах с содержанием сульфата аммония 1,0 г/л соли. Добавление сульфата аммония в концентрации 1,0 г/л увеличивает количества микроорганизмов на 30% относительно контроля.

Пример 2. Влияние гидрофосфата аммония.

Данные культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 на средах, содержащих гидрофосфат аммония, представлены в таблице 3.

Добавление гидрофосфат аммония в питательную среду оказывает минимальное влияние на рост количества бактерий по сравнению с контролем.

Пример 3. Влияние дигидрофосфата аммония.

Данные культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 в среде, содержащей дигидрофосфат аммония, представлены в таблице 4.

При концентрации дигидрофосфат аммония в питательной среде 0,75 г/л, наблюдалось увеличение количества колоний Bacillus subtilis ВКПМ В-12079. Добавление 0,75 г/л дигидрофосфата аммония улучшает рост количества колоний на 20% относительно контроля.

Таким образом, максимальное увеличение количества Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 достигается внесением в питательную среду 1,0 г/л сульфата аммония (табл. 5).

Литература

1. Биотехнология. Под ред. А. А. Баева. М.: Наука, 1984. - 309 с.

2. White A., Handler P., Smith Е.L. Principles of biochemistry. Baltimore: The Johns Hopkins University School of Medicine, 1974. - 1051 p.

3. Михайлова H.А., Гапонюк П.Я., Маркова Е.А., Марков И.А. Способ получения биопрепарата // Патент РФ №2149008, заявлено 13.10.1999, опубл. 20.05.2000.

4. Леляк А.И., Костровский В.Г., Рязанкина О.И., Набиев К.Ф., Мистюрин Ю.Н., Ноздрин Г.А. Способ получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis // Патент РФ №2105562, заявлено 14.06.1995, опубл. 27.02.1998.