Результат интеллектуальной деятельности: ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАКОВЫМ КЛЕТКАМ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно к пептиду, являющемуся фрагментом κ-казеина человека, обладающему апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека в культуре.

Апоптоз (или запрограммированная гибель клеток) представляет собой генозависимый процесс, носящий системный характер и необходимый при развитии многоклеточного организма.

Апоптотическая гибель клеток наблюдается также при различных патологических состояниях организма высших животных. Путем программируемой клеточной гибели происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например мутагенных клеток или клеток, зараженных вирусом.

Таким образом, апоптоз - широко распространенный общебиологический механизм, ответственный за поддержание постоянства численности клеток, формообразование и выбраковку дефектных клеток.

Апоптотическая гибель сопровождается характерными морфологическими и биохимическими изменениями клетки, такими как сморщивание цитоплазмы и разрушение контактов с окружающими клетками, формирование апоптотических телец, содержащих конденсированные или морфологически неизмененные органеллы. Конденсация клеток сопровождается уплотнением ядерного содержимого, агрегацией хроматина по периферии ядра и его фрагментацией, расщеплением ядерной ДНК и разрушением белков цитоскелета и ламинов.

Важной особенностью апоптоза является сохранение непроницаемости мембраны клетки. При этом содержимое погибающей клетки оказывается заключенным в совокупность окруженных мембраной апоптотических телец. Финальной стадией апоптоза является фагоцитоз апоптотических телец соседними клетками или профессиональными фагоцитами [Самуилов В.Д., Алескин А.В., Лагунова Е.М. Биохимия. 2000. Т.65, вып.8. С.1029-1046].

Апоптоз может быть индуцирован как внешними факторами - проапоптотическими цитокинами, контактом с мембраной активированных цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров, так и внутриклеточными событиями, такими как истощение метаболитов, разобщение цепи окислительного фосфорилирования, накопление нерепарируемых повреждений ядерной ДНК и т.д.

В настоящее время в литературе описаны два основных пути активации апоптоза: митохондриальный и рецепторопосредованный.

При митохондриальном пути активации критическими событиями в развитии апоптоза являются изменение проницаемости мембран, открытие митохондриальных пор, падение трансмембранного потенциала митохондрий, а также образование реактивных метаболитов кислорода.

При рецепторопосредованном апоптозе действие физиологических индукторов реализуется через клеточные рецепторы, специально предназначенные для включения программы апоптоза. Общим для рецепторов апоптоза является функционирование в виде активных гомотримеров, что позволяет одновременно использовать несколько цитоплазматических сигнальных последовательностей для связи с многочисленными сопряженными сигнальными белками [Самуилов В.Д., Алескин А.В., Лагунова Е.М. Биохимия. 2000. Т.65, вып.8. С.1029-1046].

Известно что при протеолитическом расщеплении казеина молока человека образуются регуляторные пептиды (бета-казоморфины и фосфопептиды), которые могут выступать как физиологические модуляторы метаболизма. Например, казеинфосфопептиды являются переносчиками различных микроэлементов, особенно кальция, и обладают цитомодулирующими эффектами, стимулируя активность иммунокомпетентных клеток [Meisel H., FitzGerald R.J. Curr. Pharm. Des. 2003. V.9. Р.1289-1295]. Казоморфины участвуют в обеспечении всасывания питательных веществ и последующем синтезе гормонов, иммунопептиды и казокинины обеспечивают иммунную защиту и перенос информации между эндокринной и нервной системой.

Лактоферрин, лактопероксидаза и лизоцим - основные антибактериальные белки молока. Лактоферрин обладает антивирусной активностью по отношению к таким вирусам, как цитомегаловирус и вирус иммунодефицита человека [Florisa R., Recio I., Berkhout В. Curr. Pharm. Des. 2003. V.9. P.1257-1275].

Известно также, что цитотоксическими свойствами обладают мультимерные формы альфа-лактальбумина молока. Альфа-лактальбумин - мажорный Са²⁺- связывающий белок человеческого молока с молекулярной массой 14.4 кДа, состоящий из 122 аминокислот, основная функция которого - взаимодействие с бета-1,4-галактозилтрансферазой I с образованием лактозсинтетазного комплекса [Ramakrishnan В., Boeggeman E., Qasba P.K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V.291 (5). Р.1113-1118]. Мультимерные формы альфа-лактальбумина индуцировали апоптотическую гибель клеток мышиной лимфобластоидной лейкемии L1210 и саркомы легкого человека А549, но не влияли на жизнеспособность "нераковых" клеток первичной культуры фибробластов почки человека oo(HRTEC) [Hakansson A., Andreasson J., Zhivotovsky В., et. al. Exp. Cell Res. 1999. V.246 (2). P.451-460]. Но затем было показано, что альфа-лактальбумин способен индуцировать апоптоз только в присутствии свободных жирных кислот молока (в частности, олеиновой кислоты). При этом апоптотическое действие на клетки раковых и эмбриональных линий может быть обусловлено действием жирных кислот молока, а не самим альфа-лактальбумином [Svensson M., Hakansson A., Mossberg A.-K., et. al. PNAS. 2000. V.97 (8). Р.4221-4226].

Наиболее близким к заявляемому пептиду по выполняемым функциям - прототипом, является мультимерная форма альфа-лактальбумина молока человека [Hakansson A., Zhivotovsky В., Orrenius S., et. al. PNAS. 1995. V.92 (17). Р.8064-8068]. Недостатком мультимерной формы альфа-лактальбумина молока человека является то, что она не обладает способностью вызывать апоптотическую гибель раковых клеток человека самостоятельно, в отсутствие ненасыщенных жирных кислот молока.

Технической задачей изобретения является выявление нового пептида, обладающего способностью индуцировать апоптоз раковых клеток человека.

Поставленная техническая задача достигается заявляемым пептидом, обладающим апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека.

Заявляемый пептид выделяют из молока человека с использованием серии хроматографий: ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl, ионообменная хроматография на CM-Toyopearl и аффинная хроматография на цибакрон сефарозе. Пептид представляет собой фрагмент κ-казеина человека длиной 74 аминокислотных остатка, имеет молекулярную массу около 8.6 кДа и аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 и представленную на фиг.1.

Исследование апоптотической активности пептида проводили на культуре клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Индивидуальность пептида подтверждена с помощью анализа белковых препаратов методом электрофоретического разделения в присутствии додецилсульфата натрия и методом высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии.

Структура пептида определена с помощью анализа продуктов трипсинолиза методом MALDI-TOF MS/MS спектроскопией на масс-спектрометре фирмы Bruker.

Анализ известного уровня науки и техники показал, что заявляемый пептид (условное наименование лактаптин) является новым и отличается по функциональному назначению от наиболее близких аналогов.

Пример 1. Выделение пептида из молока человека

Молоко, предоставленное донорами в различные периоды лактации (от 3 недель до 12 месяцев), центрифугировали при 500 g 20 мин, плазму молока до использования хранили в аликвотах при -70°С.

Разделение белков плазмы человеческого молока проводили с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl. Колонку (5×15 см) уравновешивали 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 6.8-8.8. После нанесения молочной плазмы (150 мл) сорбент отмывали тем же буфером и проводили элюцию ступенчатым градиентом концентраций 30, 100, 250 мМ NaCl в присутствии 20 мМ Трис-HCl рН 6.8, либо 8.8, а затем 200 мМ NaOH. Значение рН в белковых фракциях, собранных при элюции NaOH, доводили до 7-7.5 с помощью АсОН. Собранные фракции диализовали 16-18 ч против 20 мМ Tris-HCl буфера, рН 6.8 при 5°С.

Фракцию белков молока, элюируемых при нанесении молочной плазмы на DEAE-Toyopearl, наносили на колонку с CM-Toyopearl 650 М (1.2×10 см). Перед нанесением сорбент уравновешивали буфером, содержавшим 50 мM Tris-HCl, pH 8.8. Белки, не связывающиеся с сорбентом, элюировали тем же буфером, после чего проводили элюцию связавшихся белков линейным градиентом концентраций NaCl от 10 мМ до 1 М в присутствии 50 мM Tris-HCl, pH 8.8. Собранные фракции диализовали 16-18 ч против 10-кратного избытка буфера, содержавшего 10 мМ NaCl и 50 мM Tris-HCl, pH 8.8.

Фракцию белков молока, элюируемую при нанесении на CM-Toyopearl, наносили на колонку с цибакрон-сефарозой (1×10 см), предварительно уравновешенную 50 мл Tris-HCl, pH 8.8. Затем не связавшиеся белки элюировали 10 объемами буфера, содержавшего 50 мM Tris-HCl, pH 8.8. Элюцию связавшихся с цибакроном белков проводили линейным градиентом концентраций NaCl от 0 до 1 М в присутствии 50 мM Tris-HCl, pH 8.8.

Идентификацию пептида (определение аминокислотной последовательности) проводили MALDI MS/MS спектроскопией на масс-спектрометре фирмы Bruker. Для этого фракции, содержавшие заявляемый пептид, после стадии очистки на цибакрон-сефарозе объединяли, диализовали против воды, лиофилизовали и растворяли в 0.1% ТФА. Раствор наносили на колонку Protein C4 (4.6×20 мм). Элюцию проводили линейным градиентом от 0 до 100% буфера вода - 0.1% ТФА ацетонитрил с 0.1% ТФА. Объем колонки 1.9 см, скорость элюции составила 0.2 мл/мин.

Пример 2. Апоптотическая активность пептида по отношению к раковым клеткам человека в культуре

Клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 выращивали в среде IMDM с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой производства фирмы "Биолот", содержавшей 40 мкг/мл гентамицина.

После формирования 30-50% монослоя в культуральную среду добавляли исследуемый пептид (объем составлял 1/5 общего объема культуральной среды) и следили за ростом клеточной культуры в течение суток.

Действие пептида на клетки MCF-7 в культуре и выявление цитотоксического действия последнего проводили с помощью двух подходов.

Первый подход основан на превращении водорастворимого красителя МТТ в нерастворимый МТТ-формазан ферментами цитоплазмы и митохондрий жизнеспособных клеток. Так как у нежизнеспособных клеток (постапоптотические клетки, апоптотические тельца) не функционируют ферменты и отсутствуют кофакторы этого превращения, они не окрашиваются МТТ. Образовавшийся осадок МТТ-формазана в жизнеспособных клетках растворяли в изопропаноле и его количество определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны λ=560 нм.

Второй подход основан на оценке окраски цитоплазмы и ядер нежизнеспособных клеток трипановым синим, с последующим подсчетом таких клеток в камере Горяева. Подход основан на том, что цитоплазматическая мембрана жизнеспособных эукариотических клеток непроницаема для этого красителя.

Минимальная концентрация пептида (лактаптина) в культуральной среде, приводившая к индукции гибели клеток, составляет 10 мкг/мл. При использовании такой концентрации прекращается пролиферация клеточной культуры и в течение 12 ч погибает около 10% клеток. При повышении концентрации пептида (лактаптина) в среде до 100 мкг/мл за 12 часов погибает 50-70% клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7.

Поскольку данные методы позволяют оценить цитотоксическое действие пептида на эукариотические клетки, но не позволяют установить, по какому механизму, апоптотическому или некротическому, происходила гибель клеток, дополнительно, с помощью световой микроскопии, оценивали морфологические изменения ядер и цитоплазмы, с тем, чтобы дискриминировать апоптотические изменения (конденсация клеток и ядер) от некротических (увеличение объема клеток и лизис ядра). Результаты наблюдений показали, что морфологические изменения клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 под действием лактаптина полностью соответствуют апоптотическим, т.е. происходит конденсация клеток, уплотнение ядерного содержимого, агрегация хроматина по периферии ядра и фрагментация ядра с образованием апоптотических телец.

Кроме того, гибель клеток MCF-7 под действием лактаптина сопровождается снижением трансмембранного потенциала митохондрий, детектируемого по окраске родамином. При окраске родамином живых клеток этот краситель накапливается в мембранах митохондрий, при апоптотической гибели клеток окраска митохондрий родамином не происходит. Обработка клеток лактаптином инициирует апоптотические изменения в клетке, сопровождающиеся гибелью митохондрий, в результате чего апоптирующие MCF-7 не окрашиваются родамином.

Предложенный пептид, представляющий видоспецифическую фракцию белка молока человека, конкретно фрагмент κ-казеина человека, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека, может найти применение в медицине как основа для разработки лекарственной формы пептидного препарата, используемого для терапии злокачественных новообразований.