Неконкурентный ингибитор тимидинфосфорилаз

Изобретение относится к биохимиии, в частности к препаратам, которые могут применяться для предотвращения, замедления или лечения опухолей.

В ангиогенезе опухолей важное значение имеют нуклеозидфосфорилазы и, в том числе, тимидинспецифичная нуклеозидфосфорилаза (TP) - белки-ферменты, которые применяются при синтезе нуклеозидов и азотистых оснований. Эти ферменты используются в качестве биокатализаторов для синтеза многочисленных нуклеозидов в фармакологии и биотехнологической промышленности [1]. Высокое содержание TP обнаружено во многих раковых клетках, что предполагает использование ее в качестве активатора противоопухолевых препаратов [2-4]. Разработка таких соединений в качестве химиотерапевтических агентов актуальна и сейчас, a TP является одним из ключевых ферментов их активации и регуляции их концентрации и активности [5-7]. TP является одним из факторов ангиогенеза опухоли, благодаря чему называется также и PD-ECGF - тромбоцитарным эндотелиальным фактором роста. Folkman в 1971 постулировал, что рост опухоли зависит от ангиогенеза и, что развитие опухоли и образование метастазов может быть устранено посредством блокирования доступа крови к опухоли [8]. Разрабатывались и ингибиторы TP, носящие антиангиогенный характер или же препятствующие расщеплению противоопухолевых препаратов тимидинфосфорилазой [9-12]. Лишь одно соединение - ингибитор TP (Tipiracil в составе TAS-102) применяется в клинической практике на настоящий момент, но его применение сопровождается различными побочными эффектами.

На настоящий момент анти-ангиогенные препараты такие, как например бевацизумаб - моноклональные антиВЭФР антитела (Avastin, Genentech/Roche, Basel Switzerland) и ингибиторы киназ: сорафениб (Nexavar, Bayer, Leverkusen, Germany), сунитиниб (Sutent, Pfizer, New York, NY), эверолимус повсеместно применяются для лечения онкологических заболеваний, а десятки других анти-ангиогенных лекарств проходят клинические испытания [13, 14]. Однако, преимущества этих анти-ангиогенных терапий, в лучшем случае, временные и, в основном, сопровождаются развитием у опухоли резистентности. Хотя, резистентность опухоли может быть вызвана различными механизмами, как, например, слабая фармакокинетика, ограниченный прием лекарства, ускоренный распад лекарства и мутации белков мишеней, она также может быть вызвана формированием обходного пути вокруг анти-ангиогенной блокады посредством активации и регуляции дополнительных про-ангиогенных путей внутри опухоли [15, 16]. Например, в результате исследования глиобластомы пациентов, проходящих курс лечения ингибитором рецептора фактора роста эндотелия сосудов цединарибом (Recentin, Astra Zeneca, London, UK), показано, что опухоли уклоняются от анти-ангиогенной терапии за счет повышения секреции ангиогенного фактора роста-2 фибробластов и фактора-1α стромальных клеток [17]. Таким образом, крайне необходимо разрабатывать анти-ангиогенные лекарства, активность которых направлена на цели, принимающие участие в ангиогенезе. Т.к. TP играет фундаментальную роль в ангиогенезе опухолей, многие лаборатории пытались синтезировать ингибиторы TP [18].

Таким образом, разработка конкурентных и неконкурентных ингибиторов TP является важной задачей для противоопухолевой терапии. Неконкурентное ингибирование требует наличия сайтов аллостерической регуляции, но обладает несколькими достоинствами. Во-первых, оно не может быть преодолено увеличением концентрации субстрата, и во-вторых, неконкурентный ингибитор не обязан быть схожим по структуре с субстратом.

Известным неконкурентным ингибитором TP является 5-O-тритилинозин (KIN59). KIN59 состоит из пуринового основания (гипоксантин), рибозной компоненты и тритильной группы в 5'-положении рибозы. KIN59 предотвращает формирование новых кровеносных сосудов, но и способствует деградации уже существующих. Оказалось, что этот эффект не является следствием неспецифической токсичности на клетки сосудов. Более того, в отличие от ранее описанных ингибиторов TP, эта молекула не конкурирует с природными субстратами за связывание с нуклеозид или фосфат-связывающими сайтами TP, а взаимодействует с новым, ранее неизвестным аллостерическим сайтом фермента неконкурентным образом [19]. В [19, 20] доказывалась также необходимость трифенилметильной группы KIN59 для ингибирования TP и для блокирования ангиогенеза. В [20] также описываются аналоги KIN59, для которых рассчитываются константа ингибирования ТР. В результате авторами обнаружено, что замена гипоксантиновой группы KIN59 на тимин приводит к увеличению ингибирующей способности лиганда. Тем не менее, неконкурентный механизм ингибирования авторы подтверждают лишь для одного лиганда: 1-(5'-O-тритил-β-D-рибофуранозил)-тимина (TP 124).

В работе [21, 22] были обнаружены два дополнительных нуклеозид-связывающих сайта (дНСС1 и дНСС2). Авторы данной работы показали, что дНСС2 является сайтом связывания KIN59, что открывает возможность для рациональной разработки неконкурентных ингибиторов ТР.

В связи с этим предлагается альтернативный неконкурентный ингибитор пептидной природы: H-Trp-Met(O₂)-Phe-NH₂. В настоящее время лекарственные препараты на основе пептидов востребованы благодаря высокой специфичности и низкой токсичности, но требуют внутривенного введения. Хотя для окнологических заболеваний это не является препятствием, важно отметить, что в настоящее время разрабатываются и иные способы доставки. Например, перорально с использованием инсулин-пассивированных гликонаночастиц золота.

Синтез предлагаемого трипептида H-Trp-Met(O₂)-Phe-NH₂

Существо изобретения поясняется на фигурах.

Фиг. 1- Стратегия синтеза трипептида H-Trp-Met(O₂)-Phe-NH₂, С.А. - метод смешанных ангидридов.

Фиг. 2 - Схема - связывание трипептида H-Trp-Met(O₂)-Phe-NH₂ с дНСС2 посредством водородных связей и стекинг взаимодействия с Tyr379.

Фиг. 3 - Потенциал средней силы, рассчитанный методом зонтичной выборки для системы тимидинфосфорилаза - патентуемое соединение.

В процессе синтеза использовали N-метилморфолин (NMM) и L-аминокислоты фирмы Sigma-Aldrich (США); изо-бутилхлорформиат (IBCF) фирмы «Fluka» (Швейцария). Все используемые для конденсации и удаления защитных групп растворители предварительно сушили и перегоняли по стандартным методикам. Идентификация полученных соединений осуществлялась ТСХ на пластинах Merck - Kieselgel 60 F(254) в системах: метанол-хлороформ (13:60) (А), втор-бутанол - 3%-ный аммиак (100:44) (В), н-бутанол - уксусная кислота - вода - пиридин (30:3:12:10) (С), изо-пропанол - вода - 3%-ный аммиак (7:1:2) (D), н-бутанол - вода -уксусная кислота (5:4:1) (Е), изо-пропанол - вода - 3%-ный аммиак (14:2:3) (F), позволяющих констатировать полное отсутствие в испытуемых образцах исходных реагентов. Молекулярная масса была установлена на MALDI-TOF-времяпролетном масс-спектрометре Bruker UltraFlex II с программным обеспечением для сбора и обработки масс-спектров flexControl 1.1. и flexAnalys 2.2. Инфракрасные спектры были получены на ИК Фурье спектрометре ИнфраЛЮМ ФТ-10. Температуру плавления измеряли на цифровом приборе SMP20 Stuart Scientific. Удельное оптическое вращение полученных соединений определяли в стандартных условиях на автоматическом поляриметре А1-ЕПЛ (1%-ный раствор в этиловом спирте, длина кюветы 0,5 дм).

Для идентификации аминокислотных остатков в полученного трипептида проводили кислотный гидролиз в 6 н HCl при 105°С в течении 12 часов. Образующиеся свободные аминокислоты идентифицировали с помощью ТСХ в системах фенол - вода, 1:1 и н-бутанол - уксусная кислота - вода, 3:2:2

При синтезе пептидов классическим методом необходимо защищать карбоксильную группу образованием сложного эфира или амида. Однако в финальной стадии синтеза, когда приходится с пептида удалять защитные группы, возникает определенная сложность. Сложноэфирная группа либо отщепляется щелочным гидролизом, либо превращается в амидную группу. Оба эти процесса в зависимости от длины пептида в разной степени сопровождаются протеканием побочных реакций. Вариант синтеза пептида, исходя из амида С-концевой аминокислоты во многом определяется свойствами этой аминокислоты, поскольку лимитирующим моментом становится растворимость соединения.

Что касается проблемы рацемизации, которая могла иметь место в процессе синтеза защищенного трипептида, то она, согласно известным принципам химии пептидов, в случае активации карбоксильной группы методом смешанных ангидридов была незначительна т.к при реакции методом смешанных ангидридов активация карбоксильной группы проводилась при -20°С в течение 2 минут и риск рацемизации был минимален.

Первоначально рассматривался «амидный» вариант синтеза этого трипептида, однако дипептид H-Met(O₂)-Phe-NH₂ был нерастворим в условиях метода смешанных ангидридов. Поэтому синтез трипептида проводили, исходя из этилового эфира фенилаланина (H-Phe-OEt). В качестве N-защитных групп использовали Z- или Вос-группу, которые отщеплялись каталитическим гидрированием над палладием или 4н HCl в этилацетате соответственно (фиг. 1)

Boc-Met(O₂)-OH (трет-бутилоксикарбонил-метионинсульфон) и его выделение.

10,0 г (55 мМ) метионинсульфона и 2,2 г (55 мМ) NaOH растворили в 35,0 мл H₂O и 14,0 мл трет-бутилового спирта. При перемешивании при 45°С тремя порциями в течении 1 часа прибавляют 14 г (64,2 мМ) ди-трет-бутилдикарбоната (пирокарбонат). По окончанию реакции на роторном испарителе в вакууме 15 мм. р.ст. и температуре 50°С отгоняют трет-бутиловый спирт, остаток разбавляют водой в 1,5 раза, и экстрагируют гексаном (30,0 мл ×3). Затем водный раствор подкисляют раствором 13,6 г KHSO₄ в 5 мл H₂O до рН 3-3,5.

Полученный раствор в делительной воронке экстрагируют этилацетатом (25,0 мл ×4). Этилацетатные экстракты сушат безводным Na₂SO₄, растворитель удаляют в роторном испарителе при вакууме 15 мм. р.ст. при 50°С. В остатке получается масло, которое в последствии кристаллизуется в белые кристаллы. Выход кристаллического продукта 13,7 г (88%), Тпл. 112°С, R_f 0,55(А); R_f0,81(В); R_f 0,78 (С), [α]^D₂₀= +8° (с=1, спирт).

Boc- Met(O₂)-Phe-OEt

К раствору 3,1 г (1,1 ммоль) Boc-Met(O₂)-OH в 30 мл хлороформа содержащему 1,19 мл (1,1 ммоль) NMM, при -20°С и энергичном перемешивании прибавляют 1,8 мл (1,3 ммоль) IBCF, перемешивают в течение 10 мин. и прибавляют охлажденный до той же температуры раствор 2,54 г (1,1 моль) HCl⋅H-Phe-OEt и 1,19 мл (1,13 моль) NMM в 17 мл хлороформа. Перемешивают в течение 30 мин. при -10°С и 1 час при 0°С. Растворитель удаляют в вакууме, остаток растворяют в 25 мл этилацетата и промывают водой (1×5 мл), 0,5 н. NaHCO₃ (2×10 мл), 15% лимонной кислотой (2×7 мл) и водой (1×5 мл). Сушат безводным Na₂SO₄ и упаривают в вакууме.

Выход 4,2 г (84%). Т.пл. 99-101°С; [α]^D₂₀+8°; R_ƒ0,96(А), R_ƒ 0,89(В); m/z найдено [М+Н]⁺: 413,63; вычислено M(C₁₈H₂₈N₂O₅S) 412,54 Da.

HCl⋅H-Met(O₂)-Phe-OEt.

К раствору 3,5 г Boc-Met(O₂)-Phe-OEt в 9,5 мл этилацетата при 5°С прибавляют 14,5 мл этилацетата насыщенного 4н HCl. Реакционную смесь выдерживают в течение 1 часа при 20°С. Этилацетат упаривают в вакууме. Оставшееся масло сушат при 1 мм рт.ст. и растирают с эфиром. Получают кристаллисекий продукт.

Выход: 2,53 г (93%). Т.пл. 186-188°С; [α]^D₂₀ +7°; R_ƒ 0,32(А), R_ƒ 0,36(В), R_ƒ 0,24(С); m/z найдено [М+Н]⁺: 357,76; вычислено M(C₁₆H₂₄N₂O₅S) 356,43 Da.

Z-Trp-Met(O₂)-Phe-OEt

Получают аналогично Boc-Met(O₂)-Phe-OEt, исходя из коммерческого Z-Trp-OH (Карбобенззилоксикарбонил-L-триптофан) фирмы Sigma-Aldrich (США). Чистота ≥99.0%, показатель вращения плоскополяризованного света [α]^D₂₀= +2.9±0.3° (с=3% в уксусной кислоте), температура плавления 124-127°С в количестве 1,0 г (0,3 ммоль) и 1,06 г (0,3 ммоль) HCl⋅H-Met(O₂)-Phe-OEt.

Выход: 1,53 г (80%). Т.пл. 113-115°С; [α]^D₂₀+12°; R_ƒ 0,70(А), R_ƒ 0,89(В), R_ƒ 0,86(С), R_ƒ 0,85(D), R_ƒ 0,92(E); m/z найдено [M+H]⁺: 722,57; вычислено M(C₃₆H₃₉N₃O₁₁S) 721,77 Da.

Z-Trp-Met(O₂)-Phe-NH₂

0,5r (0,7 ммоль) Z-Trp-Met(O₂)-Phe-OEt вносят в ампулу, растворяют в 10 мл абсолютного этанола, насыщенного сухим аммиаком (127 мг/мл), замораживают в жидком азоте и запаивают ампулу. Оставляют при 45°С на 4 суток. Затем ампулу вскрывают и содержимое упаривают в вакууме. Маслянистый остаток растворяют в спирте и снова упаривают. Остаток растворяют в минимальном количестве спирта и высаждают эфиром. Оставляют при -18°С на 2-3 часа. Затем эфирный раствор декантируют, кристаллический остаток сушат в вакууме.

Выход 0,3 г (61%). аморф; [α]^D₂₀+10°; R_ƒ 0,55(А), R_ƒ 0,30(F); m/z найдено [M+H]⁺: 693,21; вычислено M(C₃₄H₃₆N₄O₁₀S) 692,73 Da.

Н-Trp-Met(O₂)-Phe-NH₂

0,3 г (0,047 ммоль) Z-Trp-Met(O₂)-Phe-NH₂ в 13 мл этилового спирта, содержащего 0,1 г Pd-катализатора и 0,5 мл уксусной кислоты, гидрируют до поглощения рассчитанного количества водорода. Катализатор отфильтровывают, растворитель упаривают в вакууме. Полученный маслянистый осадок после растирания в смеси эфир-гексан (1:2) кристаллизуется.

Выход: 0,2 г (86%). Т.пл. 89-90°С; [α]^D₂₀+14°; R_ƒ 0,76(А), R_ƒ 0,91(В), R_ƒ 0,77(С); m/z найдено [М+Н]⁺: 515,38; вычислено M(C₂₅H₃₀N₄O₆S) 514,59 Da.

Очистку трипептид амида проводили гель-хроматографией на колонке 265×20 мм с сефадексом G-10 в 10%-ной водной уксусной кислоте с использованием увикорда (фирмы ЛКБ) для детекции. Собирали и лиофилизовали фракции, выходящие с колонки после свободного объема.

НЕКОНКУРЕНТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ТИМИДИНФОСФОРИЛАЗЫ

Патентуемое соединение является трипептидом: H-Trp-Met(O₂)-Phe-NH₂. Его связывание происходит с дНСС2 посредством водородных связей и стекинг взаимодействия с Tyr379 (фиг. 2). Водородные связи, формируемые патентуемым соединением с белком: N_Gly132 - 2.9 - O2_LIG, N_Phe133 - 3.1 - O2_LIG, O_Glu128 - 3.2 - N1_LIG, OE1_Glu128 - 3.4 - O4_LIG, NH2_Arg115 - 3.4 - O4_LIG, NE_Arg370 - 3.5 - N5_LIG, O_Asp375 - 3.4 - N5_LIG. Связывание патентуемого соединения (LIG) в дНСС2. Зеленым приведены аминокислотные остатки (а.о.) взаимодействующие с LIG, фиолетовым - а.о. фосфат-связывающего сайта.

Влияние на прохождение реакции осуществляется за счет связывания ингибитором аминокислотных остатков Glu128 и Arg115, находящихся на концах петли L6, формирующей фосфат-связывающий карман, и участвующей в закрытии субъединицы.

По результатам расчета свободной энергии связывания ингибитора методом зонтичной выборки, свободная энергия связывания патентуемого соединения с тимидинфосфорилазой в дНСС2 составляет 3.9 ккал/моль (фиг. 3), сравнимое с аналогичным значением для KIN59 (6.0 ккал/моль).

ПРИМЕНЕНИЕ

Описываемый ингибитор потенциально можно использовать для лечения онкологических заболеваний, при которых тимидинфосфорилаза принимает участие в ангиогенезе опухоли: рак груди [23, 24], шейки матки [25, 26], толстого кишечника [27], эндометрия матки [28], пищевода [29], желудка [30-32] и легких [33, 34].

Источники информации.

1. Utagawa, Т. Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics 1 // J. Mol. Catal. B. - 1999. - 6(3). - 215-222.

2. Takebayashi, Y., Yamada, K., Maruyama, I., Fujii, R., Akiyama, S., Aikou, T. The expression of thymidine phosphorylase and thrombomodulin in human colorectal carcinomas // Cancer Lett. - 1995. - 92 (1). - 1-7.

3. Toi, M., Hoshina, S., Taniguchi, Т., Yamamoto, Y., Ishitsuka, H., Tominaga, T. Expression of platelet-derived endothelial cell growth factor/thymidine phosphorylase in human breast cancer // Int J Cancer. - 1995. - 64 (2). - 79-82.

4. Fox, S. В., Moghaddam, A., Westwood, M., Turley, H., Bicknell, R., Gatter, K.C, Harris, A. L. Platelet-derived endothelial cell growth factor/thymidine phosphorylase expression in normal tissues: an immunohistochemical study // J Pathol. - 1995. - 176 (2). - 183-90.

5. Woodman, P. W., Sarrif, A. M., Heidelberger, C. Specificity of pyrimidine nucleoside phosphorylases and the phosphorolysis of 5-fluoro-2'-deoxyuridine // Cancer Res. - 1980. - 40 (3). - 507-11.

6. Birnie, G. D., Kroeger, H., Heidelberger, C. Studies of Fluorinated Pyrimidines. Xviii. The Degradation of 5-Fluoro-2'-Deoxyuridine and Related Compounds by Nucleoside Phosphorylase // Biochemistry. - 1963. - 2 - 566-72.

7. Schwartz, E. L., Baptiste, N., Megati, S., Wadler, S., Otter, B. A. 5-Ethoxy-2'-deoxyuridine, a novel substrate for thymidine phosphorylase, potentiates the antitumor activity of 5-fluorouracil when used in combination with interferon, an inducer of thymidine phosphorylase expression // Cancer Res. - 1995. - 55 (16). - 3543-50.

8. Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications // N Engl J Med. - 1971. - 285 (21). - 1182-6.

9. Balzarini, J., Gamboa, A. E., Esnouf, R., Liekens, S., Neyts, J., De Clercq, E., Camarasa, M. J., Perez-Perez, M. J. 7-Deazaxanthine, a novel prototype inhibitor of thymidine phosphorylase // FEBS Lett. - 1998. - 438 (1-2). - 91-5.

10. Liekens, S., Bilsen, F., De Clercq, E., Priego, E. M., Camarasa, M. J., Perez-Perez, M. J., Balzarini, J. Anti-angiogenic activity of a novel multi-substrate analogue inhibitor of thymidine phosphorylase // FEBS Lett. - 2002. - 510 (1-2). - 83-8.

11. Esteban-Gamboa, A., Balzarini, J., Esnouf, R., De Clercq, E., Camarasa, M. J., Perez-Perez, M. J. Design, synthesis, and enzymatic evaluation of multisubstrate analogue inhibitors of Escherichia coli thymidine phosphorylase // J Med Chem. - 2000. - 43 (5). - 971-83.

12. Balzarini, J., Degreve, B., Esteban-Gamboa, A., Esnouf, R., De Clercq, E., Engelborghs, Y., Camarasa, M. J., Perez-Perez, M. J. Kinetic analysis of novel multisubstrate analogue inhibitors of thymidine phosphorylase // FEBS Lett. - 2000. - 483 (2-3). - 181-5.

13. Bergers, G., Hanahan, D. Modes of resistance to anti-angiogenic therapy // Nat Rev Cancer. - 2008. - 8 (8). - 592-603.

14. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? // Nat Rev Drug Discov. - 2007. - 6 (4). - 273-86.

15. Shimada, H., Hoshino, T., Okazumi, S., Matsubara, H., Funami, Y., Nabeya, Y., Hayashi, H., Takeda, A., Shiratori, T., Uno, T., Ito, H., Ochiai, T. Expression of angiogenic factors predicts response to chemoradiotherapy and prognosis of oesophageal squamous cell carcinoma // Br J Cancer. - 2002. - 86 (4). - 552-7.

16. Fernando, N. T., Koch, M., Rothrock, C., Gollogly, L. K., D'Amore, P. A., Ryeom, S., Yoon, S. S. Tumor escape from endogenous, extracellular matrix-associated angiogenesis inhibitors by up-regulation of multiple proangiogenic factors // Clin Cancer Res. - 2008. - 14 (5). - 1529-39.

17. Batchelor, T. T., Sorensen, A. G., di Tomaso, E., Zhang, W. T., Duda, D. G., Cohen, K. S., Kozak, K. R, Cahill, D. P., Chen, P. J., Zhu, M., Ancukiewicz, M., Mrugala, M. M., Plotkin, S., Drappatz, J., Louis, D. N., Ivy, P., Scadden, D. T., Benner, T., Loeffler, J. S., Wen, P. Y., Jain, R. K. AZD2171, a pan-VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor, normalizes tumor vasculature and alleviates edema in glioblastoma patients // Cancer Cell. - 2007. - 11 (1). - 83-95.

18. Perez-Perez, M. J., Priego, E. M., Hernandez, A. I., Camarasa, M. J., Balzarini, J., Liekens, S. Thymidine phosphorylase inhibitors: recent developments and potential therapeutic applications // Mini Rev Med Chem. - 2005. - 5(12). - 1113-23.

19. Liekens, S., Hernandez, A. I., Ribatti, D., De Clercq, E., Camarasa, M. J., Perez-Perez, M. J., Balzarini, J. The nucleoside derivative 5'-O-trityl-inosine (KIN59) suppresses thymidine phosphorylase-triggered angiogenesis via a noncompetitive mechanism of action // J Biol Chem. - 2004. - 279 (28). - 29598-605.

20. Liekens, S., Bronckaers, A., Hernandez, A. I., Priego, E. M., Casanova, E., Camarasa, M. J., Perez-Perez, M. J., Balzarini, J. 5'-O-tritylated nucleoside derivatives: inhibition of thymidine phosphorylase and angiogenesis // Mol Pharmacol. - 2006. - 70 (2). - 501-9.

21. Balaev, V. V., Lashkov, A. A., Gabdulkhakov, A. G., Dontsova, M. V., Seregina, T. A., Mironov, A. S., Betzel, C, Mikhailov, A. M. Structural investigation of the thymidine phosphorylase from Salmonella typhimurium in the unliganded state and its complexes with thymidine and uridine // Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. - 2016. - 72 (Pt 3). - 224-33.

22. Balaev, V. V., Lashkov, A. A., Prokofev, I. I., Gabdulkhakov, A. G., Seregina, T. A., Mironov, A. S., Betzel, C., Mikhailov, A. M. Substrate specificity of pyrimidine nucleoside phosphorylases of NP-II family probed by X-ray crystallography and molecular modeling // Crystallography Reports. - 2016. - 61 (5). - 830-841.

23. Moghaddam, A., Zhang, H. T., Fan, T. P., Hu, D. E., Lees, V. C., Turley, H., Fox, S. B., Gatter, K. C, Harris, A. L., Bicknell, R. Thymidine phosphorylase is angiogenic and promotes tumor growth // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1995. - 92 (4). - 998 - 1002.

24. Toi, M., Ueno, T., Matsumoto, H., Saji, H., Funata, N., Koike, M., Tominaga, T. Significance of thymidine phosphorylase as a marker of protumor monocytes in breast cancer // Clin Cancer Res. - 1999. - 5 (5). - 1131-7.

25. Fujimoto, J., Sakaguchi, H., Hirose, R., Wen, H., Tamaya, T. Clinical implication of expression of platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) in metastatic lesions of uterine cervical cancers // Cancer Res. - 1999. - 59 (13). - 3041-4.

26. Fujimoto, J., Sakaguchi, H., Aoki, I., Tamaya, T. The value of platelet-derived endothelial cell growth factor as a novel predictor of advancement of uterine cervical cancers // Cancer Res. - 2000. - 60 (13). - 3662-5.

27. Zhang, J. M., Mizoi, T., Shiiba, K., Sasaki, I., Matsuno, S. Expression of thymidine phosphorylase by macrophages in colorectal cancer tissues // World J Gastroenterol. - 2004. - 10 (4). - 545-9.

28. Tanaka, Y., Kobayashi, H., Suzuki, M., Kanayama, N., Terao, T. Thymidine phosphorylase expression in tumor-infiltrating macrophages may be correlated with poor prognosis in uterine endometrial cancer // Hum Pathol. - 2002. - 33 (11). - 1105-13.

29. Matsushita, S., Nitanda, T., Furukawa, T., Sumizawa, T., Tani, A., Nishimoto, K., Akiba, S., Miyadera, K., Fukushima, M., Yamada, Y., Yoshida, H., Kanzaki, T., Akiyama, S. The effect of a thymidine phosphorylase inhibitor on angiogenesis and apoptosis in tumors // Cancer Res. - 1999. - 59 (8). - 1911-6.

30. Takahashi, Y., Bucana, C. D., Akagi, Y., Liu, W., Cleary, K. R, Mai, M., Ellis, L. M. Significance of platelet-derived endothelial cell growth factor in the angiogenesis of human gastric cancer // Clin Cancer Res. - 1998. - 4 (2). - 429-34.

31. Shimaoka, S., Matsushita, S., Nitanda, T., Matsuda, A., Nioh, T., Suenaga, T., Nishimata, Y., Akiba, S., Akiyama, S., Nishimata, H. The role of thymidine phosphorylase expression in the invasiveness of gastric carcinoma // Cancer. - 2000. - 88 (10). - 2220-7.

32. Takebayashi, Y., Miyadera, K., Akiyama, S., Hokita, S., Yamada, K., Akiba, S., Yamada, Y., Sumizawa, T., Aikou, T. Expression of thymidine phosphorylase in human gastric carcinoma // Jpn J Cancer Res. - 1996. - 87 (3). - 288-95.

33. O'Byrne, K. J., Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Cox, G., Turley, H., Steward, W. P., Garter, K., Harris, A. L. Vascular endothelial growth factor, platelet-derived endothelial cell growth factor and angiogenesis in non-small-cell lung cancer // Br J Cancer. - 2000. - 82 (8). - 1427-32.

34. Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Kakolyris, S., O'Byrne, K. J., Apostolikas, N., Skarlatos, J., Gatter, K. C., Harris, A. L. Different patterns of stromal and cancer cell thymidine phosphorylase reactivity in non-small-cell lung cancer: impact on tumour neoangiogenesis and survival // Br J Cancer. - 1998. - 77 (10). - 1696-703.