Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СИНТЕЗА 2-[3-(2-ХЛОРЭТИЛ)-3-НИТРОЗОУРЕИДО]-1,3-ПРОПАНДИОЛА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к синтезу соединений, обладающих противоопухолевой активностью, и может быть использовано для синтеза 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола, обладающего противоопухолевой активностью.

Соединение 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола формулы

является биологически активным соединением и обладает противоопухолевой активностью в отношении мышей и крыс. Соединение зарегистрировано во ВНИИ по БИХС под номером 10181391 от 19.02.91.

Известен способ синтеза 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (патент RU 2068843, опубл. 6 августа 1992 г.). Этот способ является ближайшим аналогом.

В настоящее время синтез 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола промышленным способом не осуществляется.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств синтеза 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола, повышение степени очистки промежуточного и конечного продуктов синтеза.

Указанный технический результат достигается в способе синтеза 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола, включающем взаимодействие 2-хлорэтилизоцианата с 2-амино-1,3-пропандиолом в присутствии ацетонитрила с получением промежуточного продукта 2-[3-(2-хлорэтил)уреидо]-1,3-пропандиола, который нитрозируют в водном растворе кислоты с помощью нитрита натрия, в котором при получении промежуточного продукта используют смесь ацетонитрил-метанол в соотношении 2:1, а нитрозирование проводят в присутствии 50% водного раствора муравьиной кислоты по следующей схеме

где:

1. - 2-хлорэтилизоцианат;

2. - 2-амино-1,3-пропандиол в смеси ацетонитрил-метанол 2:1;

3. - промежуточный продукт 2-[3-(2-хлорэтил)уреидо]-1,3-пропандиол;

4. - конечный продукт 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол.

Взаимодействием 2-хлорэтилизоцианата (1) с 2-амино-1,3-пропандиолом (2) в смеси ацетонитрил-метанол получают 2-[3-(2-хлорэтил)-уреидо]-1,3-пропандиол (3), который нитрозируют в 50%-ном растворе муравьиной кислоты с помощью нитрита натрия, получая 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол (4).

2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол - бледно-желтое мелкокристаллическое вещество, температура плавления 91-92°С. Индивидуальность полученного соединения доказана методом ВЭЖХ, строение ЯМР ¹Н и масс-спектрами. Преимущества нового способа синтеза 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола заключаются в том, что:

1. на стадии получения промежуточного продукта 2-[3-(2-хлорэтил)уреидо]-1,3-пропандиола при использовании смеси растворителей ацетонитрил - метанол в соотношении 2:1 вместо индивидуального ацетонитрила удается полностью растворить исходные реагенты, что позволяет достичь более полной конверсии реакции и получить промежуточный продукт лучшего качества;

2. аналогично при использовании 50%-ного водного раствора муравьиной кислоты на стадии нитрозирования 2-[3-(2-хлорэтил)уреидо]-1,3-пропандиола вместо 50%-ного водного раствора уксусной кислоты удается достичь более полной конверсии реакции и повысить чистоту продукта;

3. дополнительная очистка конечного продукта 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола методом колоночной хроматографии на силикагеле с последующим переосаждением из смеси этилацетат-пентан позволяет получить продукт высокого качества (98-99%), по данным анализа ВЭЖХ). Достичь такую высокую чистоту продукта с помощью ближайшего аналога было невозможно.

Сущность способа иллюстрируется фиг. 1-7, где:

на фиг. 1 - графическое изображение влияния ломустина и 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола на рост перевитой внутримышечно опухоли Эрлиха. Обозначения на графике: различия с группой контроля статистически достоверны: * - p<0,05; различия с группой, получавшей ломустин, статистически достоверны: # - p<0,05;

на фиг. 2 - влияние ломустина и 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола на рост меланомы В16 у мышей (C57BL/CBA)F1. Обозначения на графике: различия с группой контроля статистически достоверны: * - p<0,05; различия с группой, получавшей ломустин, статистически достоверны: # - p<0,05;

на фиг. 3 - влияние 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола на выживаемость мышей с лейкемией Р388 (log-rank тест: p<0,0001);

на фиг. 4 - влияние 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола в дозе 10 мг/кг на рост карциносаркомы W-256 у крыс. Различия с группой контроля статистически достоверны: * - p<0,001;

на фиг. 5 - влияние 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединение) в дозе 15 мг/кг на рост карциносаркомы W-256 у крыс. Различия с группой контроля статистически достоверны: * - p<0,00;

на фиг. 6 - влияние 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) в дозе 10 мг/кг на выживаемость крыс с карциносаркомой W-256;

на фиг. 7 - влияние 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) в дозе 15 мг/кг на выживаемость крыс с карциносаркомой W-256.

Получение 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола и его биологические свойства иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Синтез 2-[3-(2-хлорэтил)уреидо]-1,3-пропандиола.

К перемешиваемому раствору 6,4 г (0,06 моль) 2-хлорэтилизоцианата (1) в 40 мл смеси ацетонитрил-метанол (2:1) при 0°C по каплям добавляли 5 г (0,05 моль) 2-амино-1,3-пропандиола (2) в 80 мл той же смеси растворителей. Продукт выпадал в осадок в ходе реакции. Спустя 10 минут после добавления всего амина осадок отфильтровывали и промывали 100 мл ацетонитрила. Полученный бесцветный порошок сушили при 45°С. Выход 8,29 г (78%). Продукт по данным ЯМР имел чистоту порядка 85% и был использован на следующей стадии без дополнительной очистки. ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-Д₆) δ м.д.: 3,22-3,36 (м, 4Н); 3,40-3,44 (м, 2Н); 3,49 (квинтет, 1Н); 3,55 (т, 2Н); 4,57 (т, 2Н); 5,92 (д, 1Н); 6, 34 (т, 1Н).

Пример 2. Синтез 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола 6 г (30,6 ммоль) полученного неочищенного 2-[3-(2-хлорэтил)уреидо]-1,3-пропандиола (3) растворяли в 66 мл 50%-ной водной муравьиной кислоты, раствор становился гомогенным. Охлаждали до -5°-0°С и порциями добавляли 4,8 г (2,2 экв.) нитрита натрия в течение часа. После первого добавления нитрита натрия температуру реакционной смеси доводили до 0°С. Окраска раствора постепенно становилась желтоватой. Контроль окончания реакции проводили по ТСХ в системе дихлорметан-метанол 9:1. Затем растворитель отгоняли в вакууме (8-10 мм, температура бани 23-26°С). К остатку добавляли 100 мл воды и 20 мл этилацетата, экстрагировали этилацетатом (7*10 мл), водный слой при этом становился бесцветным. Объединенные органические фазы сушили над безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняли в вакууме при температуре бани 25°С. Сырой продукт очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле при градиентном элюировании в системе петролейный эфир - этилацетат 1:2 постепенно увеличивая полярность до 1:7. Исходную смесь растворяли в 2 мл элюента с добавкой 2 мл дихлорметана. Объединенные фракции, содержащие продукт, после концентрирования растворяли в 80 мл этилацетата, затем на магнитной мешалке при среднем перемешивании медленно прикапывали 200 мл перегнанного пентана. Выпадал желтоватый мелкий кристаллический осадок. После выдерживания в холодильнике в течение 30 минут осадок отфильтровывали, промывали 10 мл пентана, сушили в вакууме (2 мм) в эксикаторе. Выход 2,94 г (43%) в виде бледно-желтых кристаллов. Чистота продукта, по данным ВЭЖХ порядка 98-99%. Температура плавления = 91-92°С ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-Д₆) δ м.д.: 8.11 (д, 1H, J=8.3 Гц, NH), 4.73 (т, 2Н, J=5.7 Гц,), 4.09 (т, J=6.4 Гц, 2Н), 3.95-3.84 (м, 1H), 3.60 (т, J=6.4 Гц, 2Н), 3.54 (т, J=5.8 Гц, 4Н). Масс спектр ESI, m/z, C₆H₁₂ClN₃O₄⁺ (M+Na⁺): Вычислено: 248,0414; 250,0385. Найдено: 248,0418; 250,0380. Эти характеристики 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуридо]-1,3-пропандиол сохранял более 2 часов в растворе в условиях затемнения.

Для сравнительной оценки влияния 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуридо]-1,3-пропандиола использован его ближайший структурный аналог - противоопухолевый препарат ломустин (CCNU), синтезированный в США (Broder L.E, Carter S.K. CCNU, Clinical Brochure, Bethesda, Md, NCI., 1971), представляющий собой 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевину. Ломустин применяют при первичных и метастатических опухолях головного мозга, меланоме, злокачественных лимфомах, раке желудка и кишечника, мелкоклеточном раке легкого, почечноклеточном раке, множественной миеломе.

Противоопухолевая активность заявляемого соединения подтверждается следующими экспериментальными примерами.

Пример 3. Применение 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола в лечении перевитой внутримышечно опухоли Эрлиха.

Исследование было проведено на 36 мышах BALB/c самках. После внутримышечной трансплантации опухоли все мыши были рандомизированы на 3 группы по 12 животных в группе. Мыши первой группы служили контролем, мышам второй группы был введен ломустин в максимально переносимой дозе 50 мг/кг однократно перорально с помощью желудочного зонда, мышам третьей группы был введен 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол в нетоксичной дозе 15 мг/кг однократно внутрибрюшинно (в/б). Оба препарата были введены на шестой день после перевивки, когда у всех животных уже имелась четко определяемая опухоль.

Под влиянием ломустина торможение роста опухоли в различные сроки после перевивки составило 33-39%, а под влиянием 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола - 50-81%) (табл. 1).

Примечание: препараты были введены однократно на 6 день после трансплантации опухоли; Т% - процент торможения роста опухоли; (I) - Т% и p по отношению к I группе; (II) - Т% и p по отношению к II группе.

Графически эти результаты воспроизведены на фиг. 1.

Интегральными показателями эффективности терапии, отражающими не только выраженность противоопухолевого эффекта, но и его устойчивость, могут служить площади под кинетическими кривыми роста опухоли (S), а также индексы роста опухоли (ИРО), представляющие собой отношение S в исследуемой группе к S в контрольной группе (табл. 2).

Обозначения: (I) - p по отношению к I группе; (II) - p по отношению ко II группе.

Из табл. 2 видно, что противоопухолевый эффект заявляемого соединения у мышей с опухолью Эрлиха почти вдвое превосходил эффект ломустина (p<0,01). Площадь под кинетической кривой роста опухоли у мышей, получивших ломустин, была меньше, чем в контроле, в 1,5 раза, а у мышей, получивших заявляемое соединение, была в 3,2 раза меньше, чем в контроле, и в 2,1 раза меньше, чем у получивших ломустин (p<0,01).

Пример 4. Влияние ломустина и 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола на рост меланомы В16 у мышей (C57BL/CBA)F1.

Исследование проведено на 25 мышах-самцах гибридах (C57BL/CBA)F1. Всем мышам была перевита меланома В16 внутримышечно. После перевивки опухоли животные были рандомизированы на 3 группы:

I группа - контроль (n=8);

II группа - ломустин 50 мг/кг внутрь (n=9);

III группа - 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол 15 мг/кг в/б (n=8).

Препараты были введены однократно через 72 часа после перевивки опухоли.

Обозначения: (I) - Т и p к I группе, (II) - Т p ко II группе, (I) - Т и p к III группе,

Как видно из табл.3, под влиянием ломустина торможение роста опухоли в различные сроки после перевивки составляло по сравнению с контролем от 7 до 90%, а под влиянием 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола - от 81 до 100%. По сравнению с мышами, получившими ломустин, торможение роста опухоли под влиянием заявляемого соединения составляло от 79 до 100%.

Обозначения: (I) - p к I группе, (II) - p ко II группе, (I) - p к III группе.

Как видно из табл. 4, судя по площади под кинетической кривой роста опухоли (S) и индексу роста опухоли (ИРО), 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол почти в 5 раз превосходил по эффективности ломустин.

Пример 5. Изучение терапевтического эффекта 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозуреидо]-1,3-пропандиола у мышей с лейкемией Р-388.

Лейкемия Р-388 была трансплантирована 19 мышам-самкам DBA₂ посредством в/б введения 10⁶ клеток лейкемии Р-388 в 0,2 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида на каждую мышь. После перевивки мыши были рандомизированы на 2 группы:

I группа - контроль(n=11);

II группа - 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол 15 мг/кг в/б (n=8).

2-[3-(2-Хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол был введен через 24 часа после перевивки опухоли в дозе 15 мг/кг внутрибрюшинно в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида из расчета по 0,2 мл на 20 г массы тела мыши. Контрольным мышам было введено соответствующее количество 0,9% раствора натрия хлорида. К 14 дню после перевивки все 11 мышей контрольной группы погибли, тогда как из 8 мышей, которым был введен 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол, не погибла ни одна мышь (p<0,0001) (фиг. 3).

Примечание: МПЖ - медиана продолжительности жизни, УПЖ - увеличение продолжительности жизни; 95% ДИ - 95%-ный доверительный интервал.

Как видно из табл. 5, медиана продолжительности жизни (МПЖ) составила соответственно 12 и 32 дня (p<0,001). Под влиянием заявляемого МПЖ возросла на 170% (табл. 5).

Пример 6. Влияние 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола на рост и метастазирование карциномы легкого Льюис.

Исследование проведено на 14 мышах C57BL самках. Всем мышам была перевита подкожно карцинома легкого Льюис. Мыши были рандомизированы на 2 группы по 7 мышей в группе:

I группа - контроль (n=7);

II группа - 2-[3-(2-Хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол 20 мг/кг в/б однократно через 24 часа после перевивки (n=7).

Как видно из табл. 6, к 40 дню после перевивки все 7 мышей контрольной группы погибли. У всех имелись подкожные опухоли и множественные метастазы в легких (от 40 до 100 метастазов у каждой мыши). К 40 дню после перевивки все 7 мышей, получивших заявляемое соединение, оставались живы (р=0,0002). Из 7 мышей опухоль под кожей определялась только у одной (р=0,0007) и только у нее имелись метастазы в легких (р=0,0007), количество метастазов - 21.

Пример 7. Влияние 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола на рост кациносаркомы W-256 у крыс.

У крыс с перевитой под кожу карциносаркомой W-256 под влиянием 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуриидо]-1,3-пропандиола, введенного однократно в/б в дозе 10 мг/кг через 24 часа после перевивки, торможение роста опухоли в различные сроки наблюдения составило от 97,9% до 99,9% и у 3 из 8 животных наступило полное излечение; при дозе 15 мг/кг полное излечение без последующих рецидивов (наблюдение свыше 90 дней) было достигнуто у 100% животных (табл. 7, фиг. 4-7).

Однократное введение 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола в дозе 10 мг/кг вдвое увеличило МПЖ крыс с карциносаркомой W-256 в 2 раза, а в дозе 15 мг/кг - более чем в 5 раз (табл. 8).

Примечание: МПЖ - медиана продолжительности жизни, УПЖ - увеличение продолжительности жизни; 95% ДИ - 95%-ный доверительный интервал.

Заявляемый способ позволяет расширить арсенал средств синтеза 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола, повысить степень очистки промежуточного и конечного продуктов синтеза.