Результат интеллектуальной деятельности: Водорастворимые производные тирозина, обладающие анальгетическим, противовоспалительным и противоотечным действием

Изобретение относится к физиологически активным производным тирозина, обладающим анальгетическим, противовоспалительным и противоотечным действием. Заявляемые производные могут использоваться в косметических и лечебных целях в составе кремов, мазей или гелей с указанным спектром активности.

Известен целый ряд медицинских и косметических средств, в состав которых включены нестероидные противовоспалительные агенты, обладающие обезболивающими и противовоспалительными свойствами. Это малые молекулы различной химической структуры, наиболее важные из них для наружного использования:

1) производные салициловой кислоты, например, в комбинации с бетаметазоном дипропионатом (патент РФ №2223465, МПК А61K 31/573, опубл. 20.02.2004);

2) производные индолуксусной кислоты, а именно индометацин, в составе мази «Индометацин» (Инструкция к применению, Индометацин мазь 10%, производитель Биосинтез, Россия) и геля «Индовазин» (Инструкция к применению, Индовазин гель, 45 г);

3) производные фенилуксусной кислоты, а именно диклофенак в составе препаратов «Вольтарен Эмульгель» (Инструкция к применению, Вольтарен эмульгель, гель), «Дикловит» и др. (Инструкция к применению, Дикловит гель 1%);

4) производные пропионовой кислоты, а именно ибупрофен - «Нурофен гель» (Инструкция к применению Нурофен гель, 5%), кетопрофен - «Фастум гель» (Инструкция к применению Фастум гель) и «Кетонал гель» (Инструкция к применению Кетонал гель);

5) оксикамы, а именно пироксикам - «Пироксикам-гель» (Инструкция к применению Пироксикам гель), «Финалгель» (Инструкция к применению Финалгель);

6) производные сульфонамида, а именно нимесулид - «Найз гель» (Инструкция к применению Найз гель).

Перечисленные препараты входят в состав различных мазей, гелей и кремов, которые применяются в качестве обезболивающих и противовоспалительных средств, главным образом при лечении острых и хронических воспалительных заболеваний опорно-двигательного аппарата, а также спортивных травм (ушибов, повреждения связок и мышц). Известным недостатком нестероидных противовоспалительных препаратов является прямое или косвенное поражение слизистой желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) особенно при длительном применении (диарея, язва желудка и двенадцатиперстной кишки, желудочно-кишечные кровотечения), а также риск развития сердечно-сосудистых осложнений (инсульты, инфаркты миокарда, тромбозы периферических артерий). Кроме того, если эти препараты применяются на обширных участках в течение длительного времени и в высоких дозах, возможно возникновение системных побочных эффектов.

Известны также нестероидные противовоспалительные препараты на основе физиологически активных компонентов ядов пчел и змей.

Пчелиный яд представляет собой комплексную смесь биологически активных веществ. Он содержит ферменты, биогенные амины, аминокислоты (триптофан), пептиды - меллитин, апамин, а также холин, свободные жирные кислоты, сахара, липиды, свободные основания, органические кислоты (фосфорную), магний, микроэлементы. Пептиды составляют более 50% сухого веса пчелиного яда и обусловливают большую часть его физиологической активности. Наиболее известным средством на основе пчелиного яда является мазь «Апизартрон» (Инструкция к применению Апизартрон, мазь).

Близкой противовоспалительной и обезболивающей активностью обладают яды кобры и гадюки. В змеином яде содержатся аминокислоты и белки (в том числе ферменты); жирные кислоты, микроэлементы. Мази «Випросал», Кобратокс и др.

Препараты на основе ядов пчел и змей используются в низких дозах и не имеют таких побочных эффектов, как соединения, перечисленные выше, однако яды пчел и змей являются сильными аллергенами и могут вызвать у пациента аллергическую реакцию. Кроме того, сырье для подобных мазей является труднодоступным и дорогим. Это сырье трудно стандартизировать, что очень важно для промышленного производства.

Задачей данного изобретения является разработка производных тирозина для применения в составе косметических или лекарственных кремов, гелей или мазей, обладающих анальгетическим, противовоспалительным и противоотечным действием, не вызывающих побочных эффектов при наружном использовании со стороны ЖКТ, сердечно-сосудистой системы, аллергических реакций и привыкания.

Технический результат изобретения заключается в достижении анальгетического, противовоспалительного и противоотечного действия без побочных эффектов, аллергических реакций и привыкания.

Известна группа нейропептидов, являющихся эндогенными лигандами - агонистами опиоидных рецепторов. Эти пептиды обладают анальгезирующим действием. К эндогенным опиоидным пептидам относят эндорфины, энкефалины, динорфины и др. Система опиоидных пептидов головного мозга играет важную роль в формировании мотиваций, эмоций, поведенческой привязанности, реакции на стресс и боль и в контроле приема пищи. Пептиды, как правило, нетоксичны, действуют в низких дозах, не вызывают привыкания, в организме имеются ферментные системы для их деградации до аминокислот. Низкомолекулярные пептиды и производные аминокислот не обладают антигенными и иммуногенными свойствами. Пептидные субстанции доступны и легко поддаются стандартизации.

Особенностью структуры нейропептидов является наличие в их составе тирозина, который является функционально значимой аминокислотой. Сам тирозин также обладает физиологической активностью, однако его применение в качестве лекарственного препарата ограничено из-за низкой растворимости этой аминокислоты в водных средах.

Технический результат достигается путем применения производного тирозина общей формулы (I),

где R¹ представляет собой Н для приготовления лекарственного средства, обладающего противовоспалительным, обезболивающим и противоотечным действием. При этом лекарственное средство представляет собой крем или мазь.

Атом углерода в пирролидиновом кольце, помеченный звездочкой, является оптически активным и может иметь как L, так и D- конфигурацию.

Неочевидность изобретения обусловлена тем, что любой дизайн органических молекул на основе аминокислот является чисто теоретическим подходом. В ряду производных аминокислот или их аналогов не существует четкой взаимосвязи структура-активность, так как каждое модифицированное производное аминокислоты является уникальным химическим соединением, его биологическая активность не является очевидной и требует экспериментального подтверждения.

Синтез заявляемых соединений формулы (I) осуществляется методами органической химии в растворе восстановлением соответствующих производных тирозина в присутствии боргидрида натрия или алюмогидрида лития с последующим удалением защитных групп до 2-амино-3-(4-гидроксифенил)-L-пропионовой кислоты - (2-гидроксиметил-L-пирролидинамида) формулы (I). Для очистки соединений формулы (I) применяли осаждение и кристаллизацию.

X - защитная группа

Структура полученных соединений подтверждена данными 'Н-ЯМР- спектроскопии, а их гомогенность данными высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Противовоспалительное и анальгезирующее действие заявляемых производных тирозина изучали в остром эксперименте на модели формалинового отека лапы у мышей и в субхроническом эксперименте на модели адъювантного артрита у крыс. По окончании субхронического эксперимента проводили оценку синдрома отмены. Заявляемые соединения для изучения биологической активности вводили в состав нейтрального косметического крема. Острую воспалительную реакцию воспроизводили субплантарным введением в правую заднюю лапу 2% раствора формалина. Крем, содержащий заявляемые производные тирозина (далее «Крем»), наносили на лапу за 2 и 1 час до введения формалина. Противовоспалительное действие «Крема» оценивали по угнетению отека, анальгезирующее действие по поведению животных (в баллах), по двигательной активности (в тесте «открытое поле») и в тестах на физическую выносливость (статико-силовая выносливость и длительности плавания).

Результаты проведенного исследования показали, что при накожном применении «Крема» снижается болевая чувствительность и происходит уменьшение выраженности индуцированного формалином отека лапы. Угнетение отека составило в среднем 20%.

Хроническое воспаление (адъювантный артрит) моделировали на крысах самках путем субплантарного введения в заднюю лапу адъюванта Фрейнда. «Крем» наносили животным после введения адъюванта Фрейнда один раз в сутки в течение 26 дней. Противовоспалительное действие «Крема» оценивали в динамике каждые 2-3 дня по изменениям в суставах пораженной конечности и по толщине конечности.

Синдром отмены оценивали на второй день после отмены «Крема», регистрируя анальгетическую активность, двигательную активность в тесте «открытое поле», общее состояние по нарушению ушного и корнеального рефлексов, наличию судорог, тремора, птоза, прыжков, встряхивания, стука зубами, чесания, чихания, бокового положения.

В процессе субхронического эксперимента было установлено, что применение «Крема» после создания адъювантного артрита тормозит развитие воспалительного процесса. Угнетение отека составляло от 20,9% в начале исследования до 42,5% в конце исследования. Движение в суставах оставалось свободным на протяжении всего исследования.

После прекращения использования «Крема» не было выявлено синдрома отмены. Поведение и рефлексы животных не изменились.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности заявляемого «Крема» как противовоспалительного и анальгезирующего средства.

Пример 1. Синтез 2-амино-3-(4-гидроксифенил)-L-пропионовой кислоты -(2-гидроксиметил-L-пирролидинамида)

14.8 г (30 ммоль) Вос-Tyr(Вос)-Pro-ОМе растворяют в 100 мл этилового спирта (EtOH) и порциями прибавляют 4.5 г (120 ммоль, 4-кратный избыток) боргидрида натрия (NaBH₄). Реакционную смесь перемешивают 16 ч. По окончании реакции избыток NaBH₄ осторожно разлагают метанолом, смесь подкисляют с помощью уксусной кислоты (АсОН), упаривают на одну треть, добавляют этилацетат и помещают в холодильник для выпадения осадка солей. Осадок отфильтровывают, фильтрат промывают в делительной воронке водой до нейтральной реакции. Органическую фазу упаривают досуха, остаток еще 2 раза упаривают с изо-пропиловым спиртом для удаления следов воды, продукт - масло. Выход 12,1 г (85%). R_f 0.75 (система хлороформ - метанол - 32% водная АсОН 15:4:1).

Маслообразный продукт, полученный выше, растворяют в трифторуксусной кислоте (TFA) и выдерживают 40 мин. Полноту отщепления трет-бутилоксикарбонильной защиты контролируют при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ). По окончании деблокирования TFA упаривают, к остатку прибавляют эфир, осадок отфильтровывают и продукт переосаждают из минимального количества изо-пропилового спирта эфиром. Осадок отфильтровывают, сушат на воздухе. Выход 5.9 г (51%). R_f 0.3 (система хлороформ - метанол - 32% водная АсОН 15:4:1), данные высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ): время удерживания дипептида 8.14 мин, чистота 96% (колонка Kromasil С18 4.6×250 мм, размер частиц сорбента 5 мкм, буфер А - 0.1% водная TFA, буфер Б - 80% ацетонитрила + 20% буфера А, градиент Б в А от 10 до 70% за 30 мин, скорость потока 1 мл/мин, детекция при 220 нм). Структура полученных производных тирозина доказана спектрами ¹Н-ЯМР. ¹Н-ЯМР-спектры снимали на спектрометре WM-500 (Bruker) 500 МГц в DMSO-d₆ при 300 K, концентрация производных тирозина составляла 2-3 мг/мл (Фиг. 1). Химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана.

Исследование биологической активности выполнено в соответствии с регламентирующими документами.

Все процедуры в исследовании выполнены согласно утвержденному Плану исследования и Стандартным Операционным Процедурам (СОП).

Биологическая тест-система

Количество животных, задействованных в исследовании, было достаточным для полной регистрации изучаемых эффектов и статистической обработки полученных данных. Самки не были беременными или рожавшими.

Вид животных, порода/линия:

Мыши - BALB/c (самцы и самки)

Крысы - аутбредные (самки)

Начальный вес: Мыши - 28-33 г. Крысы - 210-260 г

Принципы отбора животных и распределения по группам: по весу и возрасту методом случайного отбора. Масса тела каждого животного не отклонялась от средней по группе более чем на 20%.

Все манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и других научных целей (European Conventionforthe Protectionof Vertebrate Animals Usedfor Experimentalandother Scientific Purposes (ETS 123) Strasbourg, 1986) и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях.

Методика эксперимента

Исследуемый препарат - крем для наружного применения (далее «Крем»)

Действующее вещество - заявляемые производные тирозина формулы (I)

Мышам наносили и втирали в лапку 0,02 мл «Крема», крысам 0,1 мл. Это максимально возможный объем мази, который хорошо впитывался и не оставался на поверхности кожи. Экспериментально было установлено, что 1 мл крема весит 1090 мг. Для мышей со средней массой тела 30 г доза составила 22 мг на мышь или 733 мг/кг. Для крыс со средней массой тела 250 г доза составила 109 мг 436 мг/кг.

«Крем» набирали в шприц, объемом 1 мл и дозировано наносили мышам и крысам на правую лапу, втирая массирующими движениями до полного впитывания крема.

Пример 2. Изучение противовоспалительного действия «Крема» в остром эксперименте при создании формалинового отека

Острую воспалительную реакцию воспроизводили субплантарным введением в правую заднюю лапу 2% раствора формалина в объеме 0,02 мл.

«Крем» наносили на правую лапу за 2 и 1 час до введения формалина. Контрольным животным в правую лапку втирали 0,9% раствор натрия хлорида.

После окончания наблюдения животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации. В таблице 1 показаны условия проведения острого эксперимента.

В результате субплантарного введения 0,02 мл 2% водного раствора формалина в правую заднюю лапу у мышей развивался выраженный отек. Выраженность отека оценивали по толщине опытной лапки, которую измеряли через 3 часа, 1 и 2 суток после индукции воспаления с помощью микрометра МКЦ-25 (ООО НПП «ЧИЗ»).

Противовоспалительную активность оценивали по угнетению отека, который рассчитывали для каждого интервала времени по формулам:

Прирост объема (ПО) = (толщина лапы с отеком) - (исходная толщина лапы)

Отмечено, что через 3 ч после введения формалина объем лапы у мышей самцов контрольной группы увеличился на 43,7%, самок - на 43,3%, у опытных мышей, которым дважды втирали «Крем» на 33,7% у самцов и на 36,0% у самок. В таблице 2 показано Влияние «Крема» на выраженность «формалинового» отека лапы у мышей (толщина лапки, мкм). Использование «Крема» вызвало угнетение отека на 24% у самцов и на 17% у самок. Исследование через 24 часа и 48 часов показало, что действие крема ослабевало, и угнетение отека в эти интервалы времени составило 14% и 12% у самцов и 5% и 2% у самок.

* - различие в сравнении с контролем значимо по t-критерию Стьюдента (р<0,05)

Пример 3. Изучение анальгетического действия «Крема» в остром эксперименте при создании формалинового отека

Как и в примере 2, острую воспалительную реакцию воспроизводили субплантарным введением в правую заднюю лапу 2% раствора формалина в объеме 0,02 мл.

«Крем» наносили на правую лапу за 2 и 1 час до введения формалина. Контрольным животным в правую лапку втирали 0,9% раствор натрия хлорида.

После окончания наблюдения животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации. Дизайн исследования в условиях острого эксперимента аналогичен таковому в примере 2 (см. табл. 1).

В течение первого часа после создания формалинового воспаления вели наблюдение за каждым животным, отмечая признаки боли. Через 3 часа, 1 и 2 суток мышей тестировали по двигательной активности, статико-силовой выносливости и длительности плавания. В эти периоды проводили измерение пораженной конечности и наблюдали за состоянием животных.

Поведение животных

После введения формалина у мышей в течение первых 60 минут учитывали число болевых реакций по 4 типам поведения:

0 - отсутствие реакции;

1 - лапа остается на полу, но животное на нее не опирается;

2 - лапа поднята;

3 - животное облизывает или грызет лапу, либо встряхивает или подергивает ей.

Критерием анальгетического эффекта считали достоверное уменьшение числа болевых реакций в получавшей «Крем» группе относительно контрольной группы.

Сразу после субплантарного введения формалина мыши контрольной группы проявляли сильное беспокойство, сопровождающееся вокализацией. Мыши опытной группы также проявляли беспокойство, но с отсутствием вокализации. После возвращения как контрольных, так и опытных мышей в клетку они начинали усиленно облизывать инъецированную лапу. В течение часа все мыши не опирались на пораженную конечность. В таблице 3 указано количество поднятий лапы и облизывания ее, выраженное в баллах. Как видно из таблицы, применение «Крема» снижает интенсивность болевого ответа на введение формалина.

* - различие в сравнении с контролем значимо по t-критерию Стьюдента (р<0,05)

В течение последующих двух суток поведение опытных мышей не отличалось от контрольных животных.

Двигательная активность

После создания формалинового отека через 3, 24 и 48 часов у мышей изучали двигательную активность в тесте «открытое поле». Данные сведены в таблицу 4, для этого животных по одной особи помещали в экспериментальную установку «открытое поле», которая представляет собой камеру размером 100×100×60 см. Пол камеры разделен на 16 квадратов. В течение 2 минут учитывали количество вертикальных стоек и количество пересеченных (4 лапами) квадратов. Критерием анальгезирующего действия считали достоверное увеличение показателей горизонтальной и вертикальной активности.

Мыши, которым втирали «Крем», опирались на все 4 конечности и свободно передвигались по установке, в контрольных группах многие животные еще берегли инъецированную лапу, поэтому, меньше двигались и вставали на задние лапы. Однако данные двигательной активности мышей опытных групп значимо не отличались от контрольных групп.

Физические нагрузки

Статико-силовую выносливость мышей изучали, сажая их на вертикальную сетку с подвешенным на хвост грузом, равным 7% от веса тела. Влияние препарата «Крем» на статико-силовую выносливость учитывали, регистрируя время зависания мышей на сетке опытной и контрольной групп. Критерием истощения статической силы считали время, когда мышь не могла удержаться на сетке и падала вниз. После того, как животные падали вниз, их помещали в ванну с водой (температура воды 30°С) и фиксировали время плавания (до первого погружения носовых ходов в воду). Критерием утомления и прекращения плавания считали первое ныряние с погружением носовых ходов в воду. Было замечено, что мыши опытных групп цеплялись за сетку всеми четырьмя лапами, в то время как мыши контрольных групп удерживались на ней, используя только 3 здоровые лапы. Данные экспериментов по влиянию «Крема» на физическую выносливость приведены в таблице 5. Замечено, что мыши опытных групп дольше удерживались на сетке, но статистически значимых различий между опытными и контрольными группами не выявлено.

Пример 4. Изучение противовоспалительного действия «Крема» в субхроническом эксперименте при создании адъювантного артрита.

Методика исследования

Хроническое воспаление (адъювантный артрит) моделировали на крысах самках путем субплантарного введения в правую заднюю лапу 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (Thermo Scientific™ U.S.A. Lot QB 213754 A). Воспалительную реакцию оценивали в динамике каждые 2-3 дня по интенсивности воспалительных изменений в суставах пораженной конечности, выраженной в угнетении отека, а также по изменению порогов болевой чувствительности. Первичную реакцию (отек на лапе введения) оценивали на 3-й день после инъекции адъюванта.

«Крем» наносили крысам через сутки после введения ПАФ и далее ежедневно в течение 26 суток. Контрольным крысам в правую лапу втирали 0,9% раствор натрия хлорида.

На второй день после отмены «Крема» тестировали животных на наличие синдрома отмены. В таблице 6 показаны условия проведения субхронического эксперимента.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel 2010. Вычисляли групповое среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (m). Статистическую достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента. Достоверным считали различие данных групп при р<0,05.

Течение экспериментального адъювант-индуцированного артрита характеризовалось изменением различных показателей. В течение первых 24 часов у всех крыс визуально наблюдалась гиперемия и отек задней правой конечности (место инъекции полного адъюванта Фрейнда). Также отмечалось изменение походки - животные оберегали поврежденную конечность, избегая наступать на нее, поджимали лапу кверху. С течением времени у контрольных животных отек на правой лапе увеличивался, с 12 суток эксперимента начала отекать и другая конечность (вторичная иммунологическая реакция), двигательная активность была снижена, крысы не опирались на поврежденную конечность. Опытные животные были подвижны, опирались на все конечности, вставали на задние лапы. Разница между левой и правой лапой была не заметна.

С 17-х суток эксперимента у крыс контрольной группы на поврежденной конечности начали образовываться пролежни. У некоторых животных к концу исследования на месте пролежней появились язвы.

Динамику объема пораженной конечности оценивали по толщине опытной лапки, которую измеряли на 3 сутки после создания адъювантного артрита и далее каждые 2-3 дня с помощью микрометра МКЦ-25 (ООО НПП «ЧИЗ»). Противовоспалительную активность оценивали по угнетению отека, который рассчитывали для каждого интервала времени по формулам:

Прирост объема (ПО) = (толщина лапы с отеком) - (исходная толщина лапы)

Полученные данные о влиянии «Крема» на динамику толщины пораженной конечности крыс приведены в таблице 7. Исследуемый препарат - «Крем» во всех исследуемых интервалах времени приводил к статистически значимому уменьшению толщины пораженной лапы, что свидетельствует о наличии противоотечного (антиэкссудативного) действия «Крема». Угнетение отека составляло от 20,9% в начале исследования до 42,5% в конце исследования.

* - различие в сравнении с контролем значимо по t-критерию Стьюдента (р<0,05)

** - различие в сравнении с контролем значимо по t-критерию Стьюдента (р<0,01)

Пример 5. Изучение развития синдрома отмены действия «Крема» в субхроническом эксперименте при создании адъювантного артрита.

С целью оценки возможного синдрома отмены исследовали основные показатели поведения и рефлексы животных после отмены длительного нанесения «Крема». На второй день после окончания нанесения «Крема» в условиях субхронического эксперимента при создании адъювантного артрита оценивали:

- анальгетическую активность;

- двигательную активность в тесте «открытое поле»;

- общее состояние по нарушению ушного и корнеального рефлексов, наличию судорог, тремора, птоза, прыжков, встряхивания, стука зубами, синдрома Штрауба, чесания, чихания, бокового положения.

Критерием развития синдрома отмены считали появление гиперальгетического действия, стимулирование двигательной активности и изменение общего состояния животных, относительно контрольной группы животных.

Общее состояние животных на вторые сутки после отмены «Крема» не изменилось. При нажатии пинцетом на поврежденную конечность все крысы одергивали ее, при раздражении кожи наружного слухового прохода при помощи бумажной трубочки встряхивали головой (ушной рефлекс положительный), при прикосновении к роговице глаза волоска смыкали веки (корнеальный рефлекс положительный). При наблюдении за крысами не было выявлено судорог, тремора, прыжков, встряхиваний, стука зубами, чесания, чихания. Данные эмоционально-двигательной активности крыс представлены в таблице 8. После прекращения нанесения «Крема» поведение животных не изменилось.

Следовательно:

Применение «Крема» до создания формалинового отека уменьшает болевую реакцию при введении формалина и в течение часа после введения, угнетает развитие отека в среднем на 20%. Животные, обработанные «Кремом» были более подвижны и выносливы, при передвижении использовали все 4 конечности.

Применение «Крема» после создании адъювантного артрита тормозит развитие воспалительного процесса. Угнетение отека составляло от 20,9% в начале исследования до 42,5% в конце исследования. Движение в суставах оставалось свободным на протяжении всего исследования.

После прекращения использования «Крема» не было выявлено синдрома отмены. Поведение и рефлексы животных не изменились.

Таким образом, проведенное экспериментальное исследование показало, что водорастворимые производные тирозина, используемые в составе косметических и лечебных средств показало, что он обладает выраженным противовоспалительным, анальгезирующим и антиэкссудативным действием.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Беленький М.Л. // Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., 1968, 151 с.

2. Гублер Е.В., Генкин А.А. // Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях, Л., 1973 г.

3. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. // Лабораторные животные, их разведение, содержание и использование в эксперименте. - Государственное медицинское издательство УССР, 1982. - 350 с.

4. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных // Ланиматология. - 1993. - №1 - С. 29.

5. Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

6. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, ред. А.Н. Миронов, М., «Гриф и К», 2012.

7. Требования Международного комитета по науке по использованию в экспериментальных исследованиях лабораторных животных // Бюллетень ИКЛАС. - 1978. - №24. - С. 4-5.

8. Энциклопедия лекарств. 2017. РЛС. Вып. 25 (под ред. Г.Л. Вышковского) Изд: «Веданта», 2016, 1288 стр.

9. Х.-Д. Якубке, X. Ешкайт. Аминокислоты, пептиды, белки Пер. с нем. под ред. Ю.В. Митина. Москва, «Мир» 1985. 455 стр.

10. В.К. Хугаева, В.В. Сучков, М.И. Титов. Влияние лейэнкефалина и тирозина на лимфатические и тирозина на лимфатические и кровеносные сосуды. Кардиология. 1982. т 22, №6. с. 83-86.