Способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) методами биотехнологии

Изобретение относится к биотехнологии, фармакологии, физиологии растений и может быть использовано для индустриального производства высокоценного сырья с целью получения лекарств, биологически активных добавок, функциональных пищевых продуктов, лечебно-профилактической косметики и индивидуальных биологически активных веществ.

Iris sibirica L. (ирис сибирский) - многолетнее корневищное растение, достигающее высоты 70-110 см. Листья линейные, зеленые, не жесткие, до 50-80 см длиной и 4 см шириной. Данный вид включен в региональные Красные книги в Алтайском и Ставропольском краях, Омской, Тверской, Тюменской областях как редкий, встречающийся в немногих местах. Две популяции находятся под защитой Висимского и Полистовского заповедников. Подземная часть содержит углеводы (сахароза - до 2,3%, фруктаны - до 2,7%, крахмал - до 2,5%). В листьях найдены фенолкарбоновые кислоты (кофейная, синаповая, n-кумаровая, феруловая); флавоноиды (кверцетин, мирицетин); антоцианы (дельфинидин, цианидин). Семена содержат глюкоманнаны - до 18%. Отвар используют при болезнях сердца, а также как ранозаживляющее средство. Подземная часть, цветки, семена применяют в тибетской медицине при пневмониях, бронхитах, гепатитах, хронических гастритах, гинекологических заболеваниях (Тихомирова Л.И., Базарнова Н.Г., Микушина И.В., Долганова З.В. Фармаколого-биохимическое обоснование практического использования некоторых представителей рода Iris L. (обзор) // Химия растительного сырья. 2015. №3. С. 25-34).

Известен способ получения культуры ткани (каллуса) I. sibirica L. с целью производства эфирного масла из данного вида растительного сырья (А.с. СССР №1064921. МПК: А01Н 3/02. Способ получения культуры ткани ириса / Асланянц Л.К., Маршавина З.В. Опубликовано: 07.01.1984) Данный способ предполагает получение каллусной ткани I. sibirica. В сравнении с традиционным сырьем (растений выращенных в почвенных условиях), использование каллусной массы по предлагаемому способу обеспечивает повышение качества эфирного масла, снижение себестоимости получаемого продукта, возможность непрерывного выращивания культур тканей независимо от природных условий, расширение сырьевой базы (Асланянц JI.K., Маршавина З.В. Об эфирном масле, синтезируемом культурой ткани ириса Iris sibirica // Прикладная биохимия и микробиология. 1979. Т. 15. С. 769-774; Асланянц Л.К., Маршавина З.В., Казарян А.Г. Продуктивность культуры клеток Iris sibirica L., выращенных на упрощенной питательной среде // Раст. ресурсы. 1988. Т. 24. С.107-110; Багдасарова З.М., Асланянц Л.К., Узунян Л.В. Биоконверсия терпеноидов культурой клеток ириса (Iris sibirica) // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. Т. 24. С.774-778).

Недостатками данного способа (аналога) является использование каллусной культуры и малых объемов получения сырья в лабораторных условиях.

Наиболее близким (прототипом) является способ микроклонального размножения ириса сибирского (Патент РФ №2479992, МПК А01Н 4/00 Способ микроклонального размножения ириса сибирского (I. sibirica L), / Тихомирова Л.И., Смирнов С.В., Куцев М.Г. Заявитель и патентообладатель: ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный университет». Заявка №2011143089 от 25.10.2011, патент опубликован 27.04.2013). Данный способ предполагает размножение культуре ткани I. sibirica за счет получения регенерантов прямым методом, минуя каллусную культуру, и повышение выхода саженцев за счет увеличения коэффициента размножения.

Недостатком данного способа (прототипа) является отсутствие этапа адаптации и выращивания I. sibirica, с целью получения растительной биомассы.

Задачей заявляемого изобретения является создание промышленно применимого способа получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) методами биотехнологии: микроклональным размножением и выращиванием в условиях гидропоники.

Способ реализуется в два этапа.

1 этап (получение растений-регенерантов). Цветки I. sibirica берут в фазе бутонизации, когда они плотно закрыты листочками обертки и в условиях ламинарбокса проводят стерилизацию. Части трубки околоцветника и цветоножки делят на фрагменты размером не более 3×3 мм и помещают на питательные среды.

Питательные среды готовят по прописи MS (Мурасиге и Скуга), содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводят фитогормоны в концентрациях 3мкМ НУК (α-нафтилуксусной кислоты) в сочетании с 8 мкМ БАП (бензиламинопурин). рН среды доводят до 5,8-5,9 и добавляют 0,6% агара. Среды разливают в пластиковые контейнеры (по 30 мл в каждый) или в культуральные флаконы (по 10 мл в каждый). Автоклавируют приготовленные питательные среды в течение 20 мин. при 1200°С. Экспланты культивируют в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24-260°С. Через 30 суток в ткани эксплантов развиваются вегетативные побеги, достаточной величины для пересадки на среды размножения.

На этапе собственно микроразмножения питательные среды готовят на основе MS+(2,5-10,0)мкМ БАП+1,0мкМ НУК+0,1мкМ ИМК (индолилмасляная кислота). Одной из основных проблем при микроклональном размножении является поддержание длительно пассируемой культуры. Для культуры ириса на этапе собственно микроразмножения необходимо чередовать среды с высоким содержанием БАП и низким MS+1мкМ БАП. При этом в питательные среды с низким содержанием фитогормона следует добавить L-глютамин и аденин сульфат в количестве 100 мг/л (MS+1мкМ БАП+100 мг/л L-глютамин+100 мг/л аденин сульфат). Такая схема культивирования позволяет регенерантам закладывать адвентивные и пазушные почки при высоких концентрациях, а в следующем пассаже при снижении гормональной нагрузки почки имеют возможность развиваться в побеги. Содержание негормональных стимуляторов роста L-глютамина и аденин сульфата в питательной среде оказывает положительное влияние на качество развивающихся побегов и способности их к укоренению. Необходимо четко соблюдать чередование сред, в противном случае происходит накапливание избыточного количества БАП в тканях регенерантов, что приводит к снижению коэффициента размножения, остановке роста побегов и в конечном итоге гибели растения (таблица 1, фиг. 1). На среды укоренения следует высаживать побеги только после пассирования на средах с низким содержанием БАП, дополненных негормональными стимуляторами роста, а часть побегов необходимо переносить на среды с высоким содержанием БАП для дальнейшего размножения. Укоренение проводят на питательной среде MS, дополненной 3мкМ НУК. Способность к укоренению на данной среде составляет 100%.

2 этап (получение гидропонного сырья). Растения-регенеранты вынимают из культуральных сосудов, отмывают корни в дистиллированной воде от агара, затем растения помещают в гидропонную установку промышленного образца типа «CuttingBoard 27» (производства французской GHE) на 90 суток для адаптации и выращивания растительного лекарственного сырья. Выращивание растительного лекарственного сырья ириса сибирского осуществляют на модифицированной питательной среде MS, содержащей половинный набор макросолей и микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого, при температуре 24-26°С, режим освещения: 16 часов день, 8 часов ночь.

Данный способ позволяет с 1 м² площади гидропонной установки за 3 месяца получить 1 кг сырой массы сырья или 3 кг в год сухой массы. (Фиг. 2).

Биологическую активность полученного биотехнологического сырья I. sibirica (растений-регенерантов и гидропонного сырья) в отношении простого герпеса человека изучали в сравнении с активностью традиционного сырья (интактных растений). Токсичность экстрактов I. sibirica и их противовирусную активность в отношении вируса простого герпеса исследовали в перевиваемой клеточной культуре почки зеленой мартышки VERO. За пятидесятипроцентную токсичную дозу, CD50, принимали разведение экстракта, при котором погибает 50% клеток. Пятидесятипроцентная эффективная доза, ED50, - разведение экстракта, которое защищает 50% клеток от цитопатического действия вируса. Индекс селективности, IS, или терапевтический индекс, - отношение токсичной дозы к эффективной (Finter N. В. Dye uptake methods for assessing viral cytopathogenicity and their application to interferon assays // J. Gen. Virol. 1969. №5. P. 419-427).

Как видно из табл. 2, все исследованные экстракты I. sibirica проявили противовирусную активность в отношении вируса простого герпеса. При невысокой токсичности и традиционное сырье, и биотехнологическое имеет относительно высокий индекс селективности. Особо следует отметить, что данные, полученные для традиционного сырья и биотехнологического сырья сопоставимы: все показатели отличаются не более чем в 2 раза, что не превышает ошибку метода. Наиболее сильное ингибирующее действие оказывает водный экстракт растений-регенерантов.

Примечание. Питательная среда №78-MS+1 мкМ БАП+L-глютамин+аденин сульфат 100 мг/л. * - различия с контролем достоверны при Р≤0,05