Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ПАРОДОНТИТА

Изобретение относится к области медицины, в частности, экспериментальной медицины и стоматологии и может быть использовано для изучения этиологии и патогенеза пародонтита.

Воспалительные заболевания пародонта остаются одной из наиболее актуальных проблем современной стоматологии. В настоящее время наблюдается увеличение числа больных с воспалением тканей пародонта с преобладанием в их структуре генерализованных форм гингивита и пародонтита [1]. По данным ВОЗ более 80% населения в возрасте от 60 лет и старше страдают воспалительными и воспалительно-деструктивными заболеваниями пародонта, приводящими к потере зубов, появлению очагов хронической инфекции в полости рта, микробной сенсибилизации и другим расстройствам [2].

Заболевание особенно опасно в пожилом возрасте, на фоне снижения общего иммунитета и реактивности организма, зачастую при прогрессирующей потере плотности костной ткани.

Для практического использования новых передовых методов терапии и новых препаратов при лечении пародонтита требуется отработка всех параметров внедряемых средств в эксперименте на живых организмах.

Наиболее эффективными показали себя экспериментальные модели пародонтита, воспроизведенные на животных [3].

Известен способ моделирования пародонтита, согласно которому экспериментальным животным - крысам, вводят хлористый аммоний в дозе 3,5-4,5 мг на 1 г массы тела один раз в сутки в течение не менее 30 дней [4].

Преимущества способа: быстрое получение искомой модели пародонтита.

Недостатком известного способа является то, что пародонтит моделируется метаболическим ацидозом, что дает недостаточно полную морфологическую картину моделируемой патологии, в этиологии которого ведущее место занимает острое или хроническое воспаление. Кроме этого, процесс моделирования требует ежедневных введений в пищу строго дозированного количества хлористого аммония.

Известен способ получения модели воспаления пародонта у крыс, вызванного острой механической травмой мягких тканей десны, в котором авторы под легким эфирным наркозом вводили крысам металлический крючок так, чтобы животные не могли его уронить, с губной стороны параллельно зубному ряду на глубину 1,5 мм в зубодесневую борозду в области верхних резцов [5].

Преимущества метода: простота выполнения.

Недостатком известного способа является его ненадежность и повышенная травматичность, поскольку крепление крючка в десне ничем не фиксируется и может быть нарушено животным.

Известен способ получения модели пародонтита, принятый в качестве прототипа, включающий помещение половозрелых крыс в общую клетку площадью 0,018 м на особь, в котором перед помещением в клетку под эфирным наркозом, используя стоматологический цемент, создают искусственную зубную бляшку вокруг шейки верхних и нижних резцов с шероховатой поверхностью, заходящую под десну на 0,1-0,5 мм, при этом в процессе моделирования животные получают кашицеобразную пищу [6].

Преимущества метода: сочетанное воздействие эмоционального стресса, использование механического раздражителя (стоматологический цемент) и кашицеобразной пищи, способствующей, как известно, формированию микробной бляшки на поверхности зубов и десен, относительно короткий процесс моделирования пародонтита (не более месяца).

Недостатком способа получения модели пародонтита по методу прототипа является его высокая трудоемкость, операционная травма краевой десны, сложность, обусловленная использованием специального цемента и необходимостью формирования искусственных зубных бляшек в полости рта животных для создания модели воспалительного процесса. Проявления воспаления десен, полученное с помощью методики прототипа, не типичны по своим морфологическим свойствам для пародонтита у человека.

Поставлена задача: разработать простой и надежный способ получения модели хронического пародонтита у крыс, исключающий операционную травму пародонта, обеспечивающий повышение достоверности патологического процесса, путем моделирования у подопытных животных воспаления пародонта, сходного по патоморфологическим проявлениям с пародонтитом у человека.

Поставленная задача решена за счет сочетания воздействия местных и общих факторов на фоне изменения реактивности организма, что полностью соответствует современному взгляду на этиологию пародонтита.

В заявляемом способе получения экспериментальной модели пародонтита путем воздействия эмоциональным стрессом на экспериментальных животных, например, половозрелых крыс, за счет помещения 10-11 особей в клетку при площади 0,018 м²/особь, в отличие от прототипа перед помещением в клетку каждой экспериментальной особи под общей анестезией на фоне внутрибрюшинного тиопенталового наркоза из расчета 0,1 мл 5% тиопентала натрия на 100 грамм веса животного, создают дисбактериоз ротовой полости путем внутримышечного введения линкомицина гидрохлорида дозой 30 мг 100 грамм веса животного и локального поражения десен и тканей преддверия рта аппликацией суспензии пчелиного яда в дозе 2 мг на 100 грамм веса животного. Для ускорения моделирования дополнительно к стандартному рациону питания крыс добавляют подсолнечное масло (2 мл на одного животного), которое нагревают в присутствии 2% сульфата меди в течение 24 часов до достижения перекисного числа выше 40 ед.

Аппликации проводятся в двух участках преддверия рта между нижней губой и резцами нижней челюсти и между молярами верхней и нижней челюстей и щекой справа.

Заявляемый способ создания экспериментального пародонтита отличает простота выполнения, хорошая выживаемость подопытных животных, достоверность патологического воспалительного процесса тканей пародонта, сходного по патоморфологическим проявлениям с пародонтитом у человека.

Экспериментальные исследования выполнены на 140 белых половозрелых крысах массой 220-250 г, которые находились на стандартном пищевом и водном рационе в соответствии с санитарно-гигиеническими нормами. Опыты проводили с соблюдением Международных принципов Европейской конвенции о «Защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей» (Страсбург, 1986), «Общими этическими принципами экспериментов на животных» (Россия, 2011), в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт «Принципы надлежащей лабораторной практики» ГОСТ Р 53434-2009) и положительным заключением этического комитета СтГМУ №32 от 12.02.2014. Исследование осуществлено в рамках Государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации для ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по осуществлению научных исследований и разработок по теме: «Стволовые клетки пульпы зуба в регенерации и иммуномодуляции» от 14.01.2014 №302/08 совместно с Всероссийским НИИ овцеводства и козоводства и Ставропольским государственным аграрным университетом (Ставрополь).

Все животные были разделены на 2 группы: основную и контрольную (по 70 животных в каждой группе).

В основной группе проводили моделирование экспериментального пародонтита по разработанному способу, в контрольной группе - по методу прототипа.

Пример 1 (основная группа): Брали 70 особей половозрелых крыс. Под внутрибрюшинным тиопенталовым наркозом из расчета 0,1 мл 5% тиопентала натрия на 100 грамм веса животного, создавали дисбактериоз ротовой полости путем внутримышечного введения линкомицина гидрохлорида дозой 30 мг 100 грамм веса животного. Затем проводили локальное поражение десен и тканей преддверия рта аппликацией суспензии пчелиного яда в дозе 2 мг на 100 грамм веса животного. Далее животных помещали в общую клетку при площади 0,018 м² на особь. В течение всего времени моделирования к стандартному рациону питания крыс добавляли подсолнечное масло в количестве 2 мл на одного животного, которое нагревали в присутствии 2% сульфата меди в течение 24 часов до достижения перекисного числа выше 40 ед. Признаки воспаления десны в основной группе наблюдали на 3 день эксперимента. На 14-е сутки наблюдали отечность и цианоз десны, в области резцов наблюдали появление пародонтальных карманов глубиной до 2 мм, подвижность резцов 2-3 степени. На 21-е сутки рентгенологически определяли все признаки деструкции вершины межзубной перегородки, включая лизис последней.

При микроскопическом анализе гистологических препаратов визуально отмечено появление инфильтрата стадии установившегося воспаления на 14-е сутки, что соответствует острой фазе воспаления. Появление в поле зрения плазматических клеток выявлено также на 14-е сутки, а значительное их увеличение на 21-е сутки исследования.

На фиг. 1 изображен гистологический срез зубоальвеолярного сегмента экспериментального животного на 14-е сутки исследования, на котором в поле зрения видно большое количество плазматических клеток (до 40% от всех клеток экссудата), что подтверждает наличие острого воспалительного процесса.

На фиг. 2 изображен гистологический срез альвеолярного отростка экспериментального животного на 21-е сутки исследования, на котором видна фаза прогрессирующего воспаления, плазматические клетки составляют до 80% всех клеток экссудата.

Исследованная гистологическая картина свидетельствует о хронизации воспаления и активном вовлечении иммунных механизмов воспаления от 14-х к 21-м суткам эксперимента. Количество плазматических клеток нарастает пропорционально тяжести процесса и степени разрушения тканей. Глубокие поражения претерпевают сосуды пародонта, его кровоснабжение нарушается. Прогрессирует разрушение коллагеновых тканей элементов и активная резорбция кости.

Пример 2 (контрольная группа): Брали 70 особей половозрелых крыс.

Проводили формирование модели пародонтита по методу прототипа, включающее помещение половозрелых крыс в общую клетку площадью 0,018 м² на особь, в котором перед помещением в клетку под эфирным наркозом, используя стоматологический цемент, создавали искусственную зубную бляшку вокруг шейки верхних и нижних резцов с шероховатой поверхностью, заходящую под десну на 0,1-0,5 мм. В течение всего времени моделирования животные получали кашицеобразную пищу, исключающую самоочищение зубов. Признаки начального воспаления десны (гингивита) в контрольной группе наблюдали на 20-30 день эксперимента. На 40-е сутки у части животных наблюдали отечность и цианоз десны, в области резцов наблюдали появление пародонтальных карманов глубиной 1-2 мм, появление подвижности резцов первой степени. Рентгенологических признаков деструкции вершины межзубной перегородки не установлено.

Поражение пародонта у животных контрольной группы (прототип) наблюдается лишь через 30-40 дней после начала эксперимента, однако воспалительный процесс носит характер гингивита (начальное воспаление десен) и не позволяет добиться полноценной картины пародонтита (воспаление всех тканей пародонта, подвижность зубов 2-3 степени, деструкция вершин межзубных перегородок).

Таким образом, при использовании разработанного способа моделирования экспериментального пародонтита создается изолированное поражение пародонта у каждого животного, не отягощенное какой-либо другой патологией и имеющее в своей основе как местные (локальное поражение десен, диета), так и общие (стресс) патогенетические факторы. По своим патоморфологическим проявлениям моделируемое у животных основной группы поражение аналогично картине пародонтита у человека и воспроизводится с высокой степенью надежности.

Разработанный способ позволяет изучать вопросы этиологии и патогенеза пародонтита, что является необходимым для разработки профилактических мероприятий и лечения указанной патологии.