ОПТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ХИМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ

Настоящее изобретение относится к устройству и способу для оптического контроля химической реакции в реакционной камере, содержащей реагентную текучую среду. В частности, настоящее изобретение относится к устройству для оптического контроля итерационной ступенчатой реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты, и способу оптического контроля итерационной ступенчатой реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

WO 2013/105025 A1, которая включена в настоящий текст с помощью ссылки, описывает устройство и способ для оптического контроля итерационного встраивания флуоресцентно меченых нуклеиновых кислот в молекулу, прикрепленную к поверхности подложки в виде проволочной сетки. Основываясь на сильном оптическом ограничении возбуждающего света и расщепляющего света затухающими волнами, можно считывать реакцию секвенирования без промывания поверхности. Ступенчатое секвенирование достигается с помощью использования нуклеотидов с оптически отщепляемыми блокирующими группами. После считывания встроенный нуклеотид деблокируют с помощью расщепляющего света через ту же подложку. Это гарантирует, что только связанные нуклеотиды будут разблокированы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Было бы выгодно иметь процедуру, которая делает возможной оптически контролируемую химическую реакцию, в частности реакцию нуклеинового секвенирования, с повышенной производительностью.

Эта проблема решается с помощью устройства по п.1 и способа по п.11. Предпочтительные варианты осуществления раскрыты в зависимых пунктах формулы изобретения.

В соответствии с первым аспектом вариант осуществления настоящего изобретения относится к устройству для оптического контроля химической реакции в реакционной камере, причем упомянутая камера содержит реагентную текучую среду. Устройство содержит следующие компоненты:

- Подложку, имеющую первую поверхность и противоположную первой поверхности вторую поверхность, для связывания по меньшей мере одной молекулы на первой поверхности подложки, причем упомянутая первая поверхность представляет собой стенку (границу) реакционной камеры, причем подложка обеспечивает проволочную сетку..

- Оптическое устройство, выполненное с возможностью направления света на вторую поверхность подложки для оптического индуцирования реакции фотохимического расщепления. Вследствие его воздействия данный свет будет далее называться "расщепляющим светом".

- Циркуляционное устройство для циркуляции реагентной текучей среды в реакционной камере.

"Реакционная камера" обычно представляет собой открытую полость, закрытую полость или полость, соединенную с другими полостями каналами с соединением по текучей среде.

В соответствии со вторым аспектом вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу оптического контроля химической реакции в реакционной камере, содержащей реагентную текучую среду, причем упомянутый способ содержит следующие этапы:

- Обеспечение подложки, имеющей первую поверхность и противоположную первой поверхности вторую поверхность, с молекулой, связанной на первой поверхности подложки, причем упомянутая первая поверхность представляет собой стенку реакционной камеры и при этом подложка обеспечивает проволочную сетку.

- Облучение второй поверхности подложки расщепляющим светом с длиной λ_CL волны расщепления, предпочтительно УФ-светом, с помощью оптического устройства и тем самым оптическое индуцирование реакции фотохимического расщепления.

- Циркуляция реагентной текучей среды в реакционной камере, предпочтительно по первой поверхности подложки.

Следует отметить, что все варианты осуществления настоящего изобретения, касающиеся способа, могут быть осуществлены в описанном порядке этапов, тем не менее он не обязательно является единственным и необходимым порядком этапов способа. Настоящим описаны все другие порядки и комбинации этапов способа.

Описанные устройство и способ основаны на одной и той же основной идее, то есть на циркуляции реагентной текучей среды по реакционной поверхности, которую облучают расщепляющим светом. Пояснения и варианты осуществления, описанные для устройства, являются поэтому столь же правомерными и для способа, и наоборот.

Устройство и способ делают возможными (фото)химические реакции, происходящие с высокой производительностью на поверхности подложки. Это происходит потому, что циркуляция реагентной текучей среды по поверхности гарантирует, что тепло, которое производится при облучении расщепляющим светом, уносится. Следовательно, может подаваться расщепляющий свет высокой интенсивности (силы света) без повреждения материала на поверхности, что делает возможными более высокие скорости реакции.

Далее будут более подробно описаны различные предпочтительные варианты осуществления, которые могут быть реализованы как в комбинации с устройством, так и со способом (даже если они объяснены только для одного из устройства и способа). В результате различных комбинаций вариантов осуществления могут возникать синергетические эффекты, хотя они могут быть подробно не описаны.

Циркуляция реагентной текучей среды в реакционной камере предпочтительно осуществляется таким образом, что с первой поверхности удаляется (избыточное) тепло. Это может быть достигнуто, например, если реагентная текучая среда в объеме непосредственно на первой поверхности и/или рядом с ней обменивается (перемещается) вследствие циркуляции. В частности, по меньшей мере часть циркуляции может быть ориентирована по первой поверхности подложки. Тем не менее, другие схемы циркуляции также возможны, например, с потоком текучей среды перпендикулярно и/или в сторону от первой поверхности.

Циркуляция реагентной текучей среды может происходить пассивным образом, будучи приводимой в действие, например, гравитацией, конвекцией и/или капиллярными силами. В предпочтительном варианте осуществления реагентную текучую среду активно перекачивают. Это может быть достигнуто, в частности, с помощью обеспечения циркуляционного устройства с насосным элементом. Таким образом, временной режим и/или интенсивность циркуляции реагентов может контролироваться и регулироваться пользователем и/или автоматическим контроллером. Перекачивание может, например, контролироваться в цикле обратной связи на основании измеряемой температуры (например, реагентной текучей среды) таким образом, что температура на реакционной поверхности все время поддерживается ниже заданного порога.

В другом варианте осуществления реагентная текучая среда может охлаждаться. Циркуляционное устройство может, например, содержать для этой цели охлаждающий элемент. Охлаждение может, например, быть достигнуто с помощью направления реагентной текучей среды по поверхности теплообмена, через которую избыток тепла может быть передан в охлаждающую среду (например, в окружающую атмосферу). В качестве дополнения или альтернативы, могут быть также обеспечены средства для активного охлаждения реагентной текучей среды, например, элемент Пельтье.

Циркуляционное устройство может предпочтительно содержать по меньшей мере один исполнительный механизм с пневматическим приводом, например, насос с пневматическим приводом. Это делает возможным легкую интеграцию устройства с пневматическим (микро)струйным устройством.

В другом варианте осуществления циркуляция реагентной текучей среды может быть синхронизирована с облучением расщепляющим светом. В таком контексте термин "синхронизация" будет относится к любому координированному временному режиму циркуляции, с одной стороны, и облучения, с другой стороны. В частном случае циркуляция может происходить одновременно с облучением расщепляющим светом (необязательно с каким-либо временным сдвигом и/или временной задержкой).

Уже было упомянуто, что циркуляция реагентной текучей среды препятствует перегреванию объема на поверхности подложки. Соответственно, может подаваться расщепляющий свет сравнительно высоких интенсивностей. В предпочтительном варианте осуществления интенсивность расщепляющего света составляет больше чем около 0,1 мВт/см², больше чем около 0,5 мВт/см², больше чем около 1 мВт/см² или больше чем около 5 мВт/см².

Далее будут рассмотрены другие варианты осуществления настоящего изобретения, дополнительная информация о которых может быть найдена в документе WO 2013/105025 A1.

В контексте настоящего изобретения термин "блокирующая группа" следует понимать как группу, которая блокирует синтетическую активность фермента в случае, когда блокирующая группа встроена в молекулу, над которой фермент осуществляет синтетический процесс. Блокирующая группа может, например, представлять собой блокирующую молекулу.

В контексте настоящего изобретения термин "отщепляемый" следует понимать как допускающий отщепление с помощью поглощения расщепляющего света с длиной волны λ_CL.

В контексте настоящего изобретения следует понимать, что все варианты осуществления оптического устройства, раскрытого в настоящем документе, могут быть выполнены с возможностью испускания поляризованного возбуждающего света и поляризованного расщепляющего света. Таким образом, можно использовать поляризатор или источники уже поляризованного света. Подробности будут описаны ниже.

Кроме того, термин "возбуждающий свет" в контексте настоящего изобретения относится к длине λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3 и λ_Ex4 волны, соответственно.

В соответствии с типичным вариантом осуществления настоящего изобретения представлено устройство определенного выше типа для оптического контроля последовательности нуклеиновой кислоты. В частности, данное устройство выполнено с возможностью оптического контроля итерационной ступенчатой реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты с помощью синтеза. Следует понимать, что в качестве альтернативы синтез с помощью лигирования также попадает в объем настоящего изобретения вместо секвенирования с помощью синтеза. Представленное устройство содержит подложку для связывания по меньшей мере одной молекулы на первой поверхности подложки. Устройство дополнительно содержит оптическое устройство, которое выполнено с возможностью направления возбуждающего света по меньшей мере с первой длиной λ_Ex1 волны возбуждения на подложку для возбуждения флуоресцентной метки первого нуклеотида, который встроен в молекулу, которая связана на первой поверхности подложки. Оптическое устройство дополнительно выполнено с возможностью приема и детектирования флуоресцентного света, испускаемого флуоресцентной меткой первого нуклеотида, который встроен в связанную молекулу. Кроме того, оптическое устройство выполнено с возможностью направления расщепляющего света с длиной λ_CL волны расщепления, предпочтительно УФ-света, на подложку для оптического индуцирования реакции фотохимического расщепления на первом встроенном нуклеотиде для отщепления блокирующей группы и флуоресцентной метки от первого встроенного нуклеотида. Кроме того, подложка выполнена с возможностью ограничения возбуждающего света и выполнена с возможностью обеспечения с помощью этого затухающей волны возбуждающего света на первой поверхности подложки. Кроме того, подложка выполнена с возможностью ограничения расщепляющего света, предпочтительно УФ-света, и дополнительно выполнена с возможностью обеспечения затухающей волны расщепляющего света на первой поверхности подложки. Устройство делает возможным множественное считывание, но этапы промывания больше не требуются или требуются в уменьшенном количестве, что означает единственное заполнение реагентом для всех считываний.

Ступенчатое секвенирование достигается посредством использования нуклеотидов с оптически отщепляемыми блокирующими группами. После считывания встроенный нуклеотид деблокируют с помощью расщепляющего света, такого как, например, УФ-излучение через ту же самую нанофотонную подложку. Это гарантирует, что только связанные нуклеотиды будут разблокированы.

Как будет описано подробно ниже, оптическое устройство может также быть выполнено с возможностью направления возбуждающего света первой и второй, и третьей, и четвертой длин λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3 и λ_Ex4 волн возбуждения на подложку для возбуждения флуоресцентной метки первого нуклеотида, встроенного в молекулу, связанную на первой поверхности подложки. Тем самым может быть обеспечено, что, например, четыре различных нуклеотида, таких как, например, аденин (A), и гуанин (G), и тимин (T) или урацил (U), и цитозин (C), можно будет различить, если соответствующий нуклеотид использует специфическую и различаемую флуоресцентную метку. Однако, при желании, также только две или три из четырех длин λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3 и λ_Ex4 волн возбуждения, описанных выше, могут быть направлены устройством в направлении подложки для возбуждения молекулы, то есть флуоресцентной метки нуклеотида, который встроен в связанную молекулу. Подробности относительно четырех цветовых систем, в которых используются четыре различных флуоресцентных метки для вышеописанных нуклеотидов A, G, C и T или U, будут описаны далее в данном документе более подробно в отношении нижеследующих фиг.1 и 2. Связанная молекула может представлять собой фрагмент нуклеиновой кислоты и может пониматься как нуклеиновая кислота, последовательность нуклеотидов которой определяют с помощью настоящего изобретения, и которая может представлять собой фрагмент ДНК, ДНК, РНК, мРНК или любую другую нуклеиновую кислоту.

Кроме того, специалисту в области техники секвенирования или секвенирования ДНК известно, что длины λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3 и λ_Ex4 волн выбирают в комбинации с четырьмя флуоресцентными метками, используемыми для, например, нуклеотидов A, G, C и T или U. Другими словами, длины волн выбирают таким образом, что используемые флуоресцентные метки могут быть оптически возбуждены с помощью соответствующего возбуждающего света. Кроме того, длину λ_CL волны выбирают таким образом, что желаемая реакция отщепления используемых нуклеотидов может быть вызвана оптически с помощью облучения упомянутым расщепляющим светом.

Следует отметить, что молекула, которая связана на первой поверхности подложки, может, например, представлять собой фрагмент ДНК, ДНК, РНК, мРНК или другую нуклеиновую кислоту. Кроме того, фермент, который будет описан в настоящем документе ниже, также может быть связан с первой поверхностью подложки. В контексте настоящего изобретения термин "связанный" следует понимать как состояние, в котором элемент иммобилизован на первой поверхности подложки.

В дополнение, подложка обеспечивает пятна, которые могут быть покрыты клонами идентичных молекул, для того чтобы увеличить оптический сигнал, который принимается при детектировании флуоресценции. Поэтому подложка может быть выполнена в виде матрицы таких пятен соответственно с различными клонами, так что производительность секвенирования возрастает.

Затухающая волна расщепляющего света и затухающая волна возбуждающего света могут быть сгенерированы с помощью подложки представленного устройства с помощью обеспечения проволочной сетки. Это может сделать возможным использование сфокусированного луча высокой интенсивности, так что фотооптическая реакция происходит с высокой скоростью в очень ограниченной области очень близко к поверхности. Оптическое устройство может содержать соответствующие оптические элементы для возбуждения и детектирования флуоресценции, то есть считывания, и соответствующие оптические элементы для деблокировки, то есть активации, в одном блоке оптического устройства или может также состоять из физически различаемых элементов.

Кроме того, в оптическом устройстве может содержаться соответствующий источник возбуждающего света. Кроме того, в оптическом устройстве может содержаться источник света для испускания расщепляющего света. Освещение для расщепления, то есть деблокировки, и для считывания, то есть возбуждения и детектирования флуоресценции, может, необязательно, происходить через одни и те же линзы. Однако, при желании, также могут быть представлены две различные оптические установки для деблокировки и считывания.

Кроме того, подложка может быть выполнена из полимера, например, поли(цикло)олефина, поликарбоната, сложного полиэфира или полиметилметакрилата (PMMA). Также могут быть использованы металл и полупроводники.

В соответствии с другим типичным вариантом осуществления настоящего изобретения устройство дополнительно содержит молекулу, которая связана с первой поверхностью подложки. Устройство дополнительно содержит раствор ("реагентную текучую среду") с множеством нуклеотидов и ферментом. Нуклеотиды в нем, соответственно, содержат блокирующую группу. Блокирующая группа выполнена с возможностью блокирования синтетической активности фермента, когда соответствующая группа встроена в молекулу, связанную с первой поверхностью устройства.

При желании блокирующая группа содержит флуоресцентную метку. Однако блокирующая группа и флуоресцентная метка могут быть встроены или расположены на первом нуклеотиде в различных положениях. Они могут отщепляться в одном процессе отщепления или в различных процессах отщепления. Это справедливо для любого варианта осуществления настоящего изобретения.

В качестве типичных вариантов осуществления блокирующие группы могут быть воплощены в виде 3'-блокированного обратимого терминатора или в виде 3'-деблокированного обратимого терминатора, как описано и определено в документе "Sequencing technologies, the next generation", Michael L. Metzker, Nature Review Genetics 11 (2010) 31-46. Упомянутый в нем 3'-деблокированный обратимый терминатор блокирующих групп, также называемый "деблокированным", может быть использован для блокирования активности фермента. Обратимые терминаторы можно представить как лиганды, прикрепленные к нуклеотидному/рибозному звену, которое останавливает внедрение любого последующего нуклеотида после внедрения. Они являются обратимыми, если после расщепления с помощью химических или фотохимических средств данный процесс может быть обращен, и полимераза может встраивать следующий нуклеотид. Кроме того, 3'-блокированный обратимый терминатор Metzker et al. может быть изменен, например, химически, для того чтобы он стал фотоотщепляемым. Затем может быть осуществлено фотоотщепление с помощью расщепляющего света посредством настоящего изобретения. В дополнение, в качестве блокирующих групп можно использовать другие комплексы в комбинации с соответствующим ферментом, как будет описано ниже. Специалист в данной области техники знает, какая комбинация фермента и блокирующей группы ведет к желаемому эффекту блокирования синтетической активности фермента.

В соответствии с другим типичным вариантом осуществления подложка выполнена в виде проволочной сетки для возбуждающего света и для расщепляющего света.

Проволочная сетка может содержать рисунок из металлической проволоки на, например, стеклянной подложке. Промежуток между сегментами проволоки действует как покрытый металлом пластинчатый волновод, в котором основной вклад сводится к двум основным модам. Например, для TE-поляризованного возбуждающего света, падающего на проволоку подложки настоящего изобретения, получаемая мода между сегментами проволоки представляет собой затухающую моду, имеющую типичную длину затухания, составляющую 16,8 нанометров для λ=630 нанометров. При этом предполагается, что проволока подложки залита средой, имеющей показатель преломления воды, n=1,33. Для TM-поляризованного света получаемую в результате моду для проволочной сетки называют распространяющейся модой, имеющей длину затухания, составляющую в данном примере 1,2 мкм. Например, высота проволоки может в примере составлять 60 нанометров. В ней TM-поляризованная мода передается с потерей света порядка 10% или менее, тогда как TE-поляризованная мода затухает мгновенно.

Другой способ представить проволочную сетку заключается в рассмотрении, например, сегментов алюминиевой проволоки как металлов, которые отражают возбуждающий свет с поляризацией, параллельной проволоке (TE-поляризацией), и которые передают поляризацию, ортогональную проволоке (TM-поляризацию). Максимальная передача TM-поляризованного света может быть выше чем 95%. Затухающее поле в случае падающего TE возбуждающего света изображено на фиг.3a и 3b в WO 2013/105025 A1. Возбуждающий свет и расщепляющий свет, испускаемые оптическим устройством настоящего изобретения, могут иметь такую поляризацию в данном и любом другом варианте осуществления настоящего изобретения.

Использование подложки в виде проволочной сетки представленного устройства обеспечивает экстремальное оптическое ограничение. Указанные преимущества реализуются в комбинации с быстрым фотохимическим расщеплением, которое используют для отсоединения так называемой блокирующей группы на нуклеотиде для предотвращения продолжения встраивания следующего нуклеотида. Использование проволочной сетки имеет дополнительное преимущество независимости в значительной степени от угла падения. Поэтому ее можно использовать в комбинации с фокусированными лучами для достижения высокой локальной интенсивности, тогда как остальная часть остается в темноте. Другими словами, проволочная сетка делает возможным возбуждение и чувствительность только к тем молекулам, например, фрагментам ДНК, которые очень близко расположены к поверхности в затухающем поле, и, следовательно, не происходит детектирования или воздействия на любой меченый нуклеотид за пределами затухающего поля. Например, затухающее поле может растягиваться на около 20 нанометров от первой поверхности подложки. Это может иметь место как для возбуждающего света, так и для расщепляющего света.

Подложка в виде проволочной сетки содержит вторую поверхность напротив первой поверхности, и оптическое устройство выполнено с возможностью освещения второй поверхности подложки возбуждающим светом и расщепляющим светом. Другими словами, подложки в оптическом устройстве расположены друг относительно друга таким образом, что расщепляющий свет и возбуждающий свет направлены непосредственно на вторую поверхность подложки. Это можно рассматривать как обратное излучение подложки. На передней поверхности, первой поверхности, регулярная проволочная структура представлена проволочной сеткой. Между регулярно расположенной металлической проволокой, то есть в промежутках проволочной сетки, связана или иммобилизована молекула, например, фрагменты ДНК.

Термин "возбуждающий свет" в контексте настоящего изобретения относится к длинам λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3 и λ_Ex4 волн, соответственно. Следовательно, для всех четырех длин волн возбуждения подложка гарантирует генерацию ограничения и создания затухающей волны соответствующего света. При желании можно использовать больше или меньше источников света и/или флуоресцентных меток без отхода от настоящего изобретения.

В соответствии с другим типичным вариантом осуществления настоящего изобретения реакция расщепления занимает промежуток времени t_cleavage, который зависит от интенсивности облучения расщепляющим светом. Кроме того, встраивание второго нуклеотида в связанную молекулу занимает промежуток времени t_{incorporation}. Представленное в настоящем документе устройство содержит оптическое устройство, которое приспособлено и выполнено с возможностью обеспечения облучения расщепляющим светом с такой интенсивностью, что t_cleavage < t_{incorporation}.

Фоторасщепление должно происходить только в тех молекулах, которые уже встроены и связаны с поверхностью. Реакция в объеме привела бы к деблокированным реагентам, которые могли бы быть встроены незаметно и таким образом могли бы вносить ошибки в результаты секвенирования. Поэтому было бы полезно осуществлять освещение только локально в течение короткого периода, для того чтобы сделать реакцию расщепления быстрой по сравнению со скоростью встраивания нуклеотидов ферментом. Принцип действия фермента и блокирующей группы уже описан выше. Это раскрытие применимо в пределах описанного здесь типичного варианта осуществления. Представленные варианты осуществления делают возможной синхронизацию встраивания следующих нуклеотидов и гарантируют, что детектируемый флуоресцентный сигнал обладает высокой надежностью.

Тот факт, что расщепляющий свет имеет затухающую моду по отношению к подложке, обеспечивает то преимущество, что повторное экспонирование не приводит к флуоресцентным меткам в растворе, которые обесцвечены, и которые потеряли свою функцию. Другими словами, представленный вариант осуществления предотвращает такое обесцвечивание и потерю функции флуоресцентными метками в растворе.

Для улучшения синхронизации встраивания нескольких нуклеотидов в несколько связанных молекул этап деблокировки с помощью расщепляющего света должен происходить настолько быстро, насколько возможно, то есть с наивысшей возможной интенсивностью расщепляющего света. Это может быть достигнуто с помощью фокусирования расщепляющего света, предпочтительно УФ-света, с помощью линзы и сканирования поверхности с помощью перемещения линзы или подложки. Этап деблокировки может быть выполнен после этапа считывания секвенирования. Данное считывание может быть осуществлено с помощью сканирования сфокусированным лучом или пошагового сканирования с освещением поля. Также может быть возможным воплощение расщепляющего света в виде одной вспышки, например, УФ-света для всей поверхности. С точки зрения скорости реакции для встраивания оснований для реакции секвенирования локальное время освещения расщепляющим светом должно составлять, например, меньше 1 минуты.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Типичные варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны на следующих чертежах.

Фиг.1 схематически показывает первое устройство в соответствии с типичным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг.2 схематически показывает второе устройство в соответствии с типичным вариантом осуществления настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Фиг.1 изображает устройство 100 для оптического контроля химической реакции, в данном случае, в частности, итерационной ступенчатой реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты с помощью синтеза. Устройство содержит подложку 101 для связывания по меньшей мере одной молекулы 102 на первой поверхности 103 подложки. Молекула 102, которая связана на первой или передней поверхности 103 подложки 101, может, например, представлять собой фрагмент ДНК. Первая поверхность 103 образует стенку или границу "реакционной камеры" 149, в которую может быть помещена текучая среда для обработки (в данном случае раствор 114, который описан более подробно ниже). Реакционная камера обычно представляет собой часть более крупного (микро)струйного устройства или картриджа, которые более подробно не показаны.

Кроме того, на фиг.1 показано оптическое устройство 104. Фиг.1 схематически показывает, что оптическое устройство выполнено с возможностью направления возбуждающего света 110, например, первой длины λ_Ex1 волны возбуждения на подложку. Кроме того, схематически показаны и изображены со ссылочными позициями 109, 116, 117 и 118 четыре различных нуклеотида. Например, первый нуклеотид 109 показан как тимин, T. Нуклеотид 109 содержит блокирующую группу 119. Кроме того, блокирующая группа 119 содержит первую флуоресцентную метку 105. Аналогичным образом, на фиг.1 схематически изображен второй нуклеотид 116, откуда можно видеть, что он также содержит блокирующую группу 119 и вторую флуоресцентную метку 106. Третий нуклеотид 117 также содержит блокирующую группу и третью флуоресцентную метку 107. В дополнение, схематически изображен четвертый нуклеотид 118, который также содержит блокирующую группу и четвертую флуоресцентную метку 108. При этом проба (раствор) 114 может содержать гораздо большее множество таких нуклеотидов, и нуклеотиды 109, 116, 117 и 118 показаны здесь только в качестве символического изображения.

Кроме того, фиг.1 показывает раствор 114, который заполняет реакционную камеру 149, и в котором содержатся нуклеотиды и фермент 115. В случае, когда один из показанных четырех нуклеотидов встроен в связанную молекулу 102, представленное устройство 100 предоставляет следующие преимущества. Оптическое устройство выполнено с возможностью приема и детектирования флуоресцентного света, испускаемого флуоресцентной меткой первого нуклеотида, встроенного в связанную молекулу 102.

Как можно также видеть на фиг.1, оптическое устройство выполнено с возможностью направления расщепляющего света 112 с длиной λ_CL волны расщепления на подложку. Это делает возможным оптическое индуцирование реакции фотохимического расщепления на первом встроенном нуклеотиде для отщепления соответствующей флуоресцентной метки от первого встроенного нуклеотида. Кроме того, подложка 101 выполнена с возможностью ограничения возбуждающего света таким образом, что на первой поверхности подложки создается затухающая волна возбуждающего света. Кроме того, подложка также выполнена с возможностью ограничения расщепляющего света таким образом, что на первой поверхности подложки создается затухающая волна расщепляющего света.

В варианте осуществления по фиг.1 подложка 101 выполнена в виде проволочной сетки 113 для возбуждающего света 110 и для расщепляющего света 112. Поэтому проволочная сетка 113 содержит регулярный рисунок, такой как, например, регулярная структура из металлической проволоки. Как можно видеть на фиг.1, в регулярном рисунке обеспечены щелевидные отверстия, и в этих отверстиях иммобилизованы связанные молекулы 102 на первой поверхности 103 подложки 101.

Кроме того, фиг.1 изображает блок 120 обработки, который содержит машиночитаемую среду 121, на которой сохранен компьютерный программный элемент 122. Упомянутый программный элемент 122 выполнен с возможностью выдачи команды блоку 120 обработки для дальнейшей выдачи команды устройству 100 для выполнения описанного выше и ниже способа оптического контроля итерационной ступенчатой реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты с помощью синтеза. Устройство 100 по фиг.1 выполнено с возможностью ступенчатого и оптического индуцирования встраивания нуклеотидов 109, 116, 117, 119 в последовательности, которая соответствует последовательности нуклеотидов связанной молекулы 102. В случае, когда молекула 102 представляет собой фрагмент ДНК, нуклеотиды, содержащиеся в пробе 114, встраиваются в молекулу 102 в последовательности, которая соответствует последовательности нуклеотидов молекулы 102.

Устройство дополнительно выполнено с возможностью основывать определение последовательности встроенных нуклеотидов на принятом и детектированном ответном флуоресцентном свете, испускаемом флуоресцентной меткой соответствующего встроенного нуклеотида. Поэтому представленное устройство 100 по фиг.1, во-первых, гарантирует, что возбуждающим светом 110 считываются только нуклеотиды, которые встроены в связанную молекулу 102, с помощью использования затухающей волны возбуждающего света. Во-вторых, устройство 100 по фиг.1 гарантирует, что расщепляющим светом будут разблокированы только связанные нуклеотиды, что предотвращает обесцвечивание и потерю функции нуклеотидов, которые еще не содержатся в молекуле 102, то есть не встроены в нее. Соответственно, детектированный сигнал 100 флуоресценции, который может быть виден как свет 111, является высоко надежным при определении последовательности нуклеиновых кислот.

Соответственно, улучшены как стоимость, так и скорость секвенирования нуклеиновой кислоты, такого как, например, секвенирование ДНК, осуществляемого с помощью устройства 100 по фиг.1. Необходимо меньше реагентов и ферментов, поскольку не нужен этап промывания. Устройство по фиг.1 показывает упрощение и сокращение затрат на секвенирование. Представленное устройство 100 по фиг.1 делает возможным новую комбинацию процессов, позволяя легкое считывание на основе сборки без каких-либо этапов промывания, что означает одно заполнение реагентом для всех считываний. Блокирующие группы, используемые в типичных нуклеотидах 109, 116, 117, 118, могут, например, представлять собой фотоотщепляемый 3'-деблокированный обратимый терминатор. Однако для достижения желательных и описанных выше эффектов также могут использоваться другие блокирующие группы, использующие, например, стерическое затруднение.

Кроме того, оптическое устройство 104, как показано на фиг.1, может быть выполнено с возможностью обеспечения облучения расщепляющим светом с такой интенсивностью, что продолжительность t_cleavage реакции расщепления меньше, чем время, которое занимает встраивание второго нуклеотида в молекулу 102. Поскольку продолжительность t_cleavage реакции расщепления зависит от интенсивности облучения расщепляющим светом, фиг.1 может снабжать выбранную комбинацию нуклеотидов определенной блокирующей группой и конфигурацией оптического устройства касательно интенсивности расщепляющего света. Другими словами, интенсивность расщепляющего света устройства по фиг.1 регулируется таким образом, что для используемой комбинации нуклеотидов и блокирующих групп продолжительность t_cleavage реакции расщепления меньше, чем t_{incorporation}.

При желании, в качестве дополнения или альтернативы, пользователю может быть предложена следующая схема устройства 100. Если реагентная текучая среда является неподвижной, и перемещение молекул осуществляется с помощью диффузии, то можно наблюдать их нахождение как среднее время нахождения невстроенного нуклеотида в пятне расщепляющего света. Оптическое устройство может дополнительно быть выполнено с возможностью обеспечения облучения расщепляющим светом с такой интенсивностью, что t_cleavage меньше, чем t_residence. Соответственно, не происходит деградация свободных и несвязанных нуклеотидов из-за нежелательной реакции расщепления. Таким образом, с помощью конфигурирования устройства таким образом, что t_cleavage меньше, чем t_residence, вероятность того, что невстроенный нуклеотид подвергнется расщеплению, уменьшается или исчезает. Другими словами, для предотвращения реакций расщепления в объеме среднее время нахождения молекул в затухающем поле проволочной сетки должно быть меньше или гораздо меньше, чем продолжительность реакции, требуемой для расщепления при подходящей интенсивности. При глубине затухающего поля, составляющей порядка 25 нм или меньше, и коэффициенте диффузии нуклеотида порядка 1e-10 м²/с время, которое требуется молекуле для диффузии в и из затухающего поля, может быть оценено как: (5e-8m)2/1e-10=25 мкс. В зависимости от времени освещения, требуемого для деблокировки связанных молекул, может быть получена вероятность повреждения. В предположении, что время освещения составляет 0,1 с, она будет составлять 1:4000, при времени освещения, составляющем 10 мс, она будет составлять 1:400, и так далее.

Точно так же общее повреждение пропорционально объемной доле в затухающем поле по отношению к общему объему раствора реагента. При высоте камеры, составляющей 100 мкм, отношение составляет 1:4000. Это означает, что в худшем случае повреждения всех молекул в затухающем поле только 0,025% молекул будет повреждено. При длине считывания, составляющей 100, в итоге 2,5% молекул в растворе будет повреждено (в худшем случае), что остается приемлемым с точки зрения секвенирования.

Приведенные выше соображения справедливы для неподвижной текучей среды в реакционной камере 149. Однако, если реагентная текучая среда циркулирует в реакционной камере (как описано более подробно ниже), преобладает перемещение молекул вследствие активного перекачивания, а не диффузии. Для эффективного охлаждения с помощью циркуляции текучей среды желательно менять текучую среду в объеме возбуждения многократно, например, от 10 до 100 раз за интервал между началом двух импульсов расщепляющего света. В этих условиях следует учитывать баланс между эффектом охлаждения, который требуется получить, и отсутствием расщепления слишком большого количества несвязанных нуклеотидов (поскольку расщепленные несвязанные нуклеотиды, встроенные в ДНК, не могут быть детектированы, поскольку они больше не содержат флуорофор, идентифицирующий основание). В частности, время нахождения жидкости в объеме возбуждения должно быть меньше, чем время УФ-расщепления, поскольку иначе не будет получено дополнительное охлаждение (во время УФ-расщепления).

Если предположить, что объем, который возбуждается расщепляющим светом, представляет собой цилиндр с диаметром, составляющим около 100 нм, и высотой, составляющей около 25 нм, получается очень маленький объем, составляющий около 2×10^(-8) мкл или 0,02 пл (по сравнению с общим объемом раствора, составляющим, как правило, около 1-5 мл). Следовательно, следует учитывать концентрацию меченых нуклеотидов и скорость обновления, что может приводить к замене объема около от 2 до 10 раз, возможно около от 2 до 5 раз. Поэтому на практике для 5-кратной замены всего 10 мл раствора имеет место множитель 10⁺¹¹ между объемом, облученным блокирующим УФ-светом, и полным объемом на пятно.

Далее предлагается информация об использовании устройства по фиг.1 (и фиг.2). Для улучшения синхронизации этап деблокировки должен быть проведен настолько быстро, насколько возможно, то есть с наивысшей возможной интенсивностью. Это может быть достигнуто с помощью фокусирования УФ-света с помощью линзы и сканирования поверхности с помощью перемещения линзы или подложки. Этап деблокировки выполняется после этапа считывания секвенирования. Данное считывание может быть осуществлено с помощью сканирования сфокусированным лучом или пошагового сканирования с освещением поля. В предпочтительном варианте осуществления сканирование для считывания может быть связано со сканированием для деблокировки с помощью интегрирования обоих световых лучей в одном исполнительном механизме, возможно даже в одной линзе с помощью выравнивания световых лучей. В качестве альтернативы две линзы могут быть интегрированы в одном столе, или два отдельных стола могут работать синхронно. Это также может быть реализовано с помощью подхода считывания при пошаговом сканировании, при котором УФ-этап также выполняется в режиме пошагового сканирования с помощью освещения того же поля, что и у считывающего устройства. Предпочтительный вариант осуществления будет зависеть от доступного источника УФ-света и его мощности. Можно также предусмотреть одну вспышку УФ-света для всей поверхности, если доступна достаточная мощность и/или площадь поверхности секвенирования ограничена. С точки зрения скорости реакции для встраивания оснований для реакции секвенирования локальное время УФ-освещения должно составлять значительно меньше 1 минуты.

Секвенирование с одной текучей средой с использованием проволочной сетки, а также одномолекулярное секвенирование описаны выше. Эти подходы могут использовать так называемые 3'-деблокированные обратимые терминаторы, для которых вспышка УФ-света необходима для разблокирования нуклеотида, для того, чтобы следующий меченый нуклеотид с прикрепленным флуорофором мог быть встроен полимеразой. Считывание цвета встроенного нуклеотида позволяет определять встроенное основание и, следовательно, осуществлять секвенирование.

В описанных процедурах нужен УФ-свет высокой интенсивности. Типичный диапазон значений интенсивности от около 4 мВт/см² до около 1 Вт/см². Это соответствует существенному количеству энергии, которая может вызывать нагрев проволочной сетки и буферов, содержащих реагенты.

Для того чтобы улучшить эффективность системы и избежать перегревания проволочной сетки/локальных жидкостей и даже картриджа, предлагается осуществлять циркуляцию реагентной жидкости (в данном случае буфера и требуемых ферментов/нуклеотидов) с помощью их перекачивания, например, с помощью использования пневматического перекачивания жидкости в картридже пневматической конструкции. Это будет производить охлаждающий эффект и поможет избежать локального перегревания.

Вышеуказанное предложение реализовано в устройстве 100 по фиг.1 с помощью "циркуляционного устройства" 150, которое схематически показано как канал 151, соединяющий противоположные концы реакционной камеры 149. В проиллюстрированном варианте осуществления канал 151 содержит насосный элемент 152, с помощью которого текучая среда в канале 151 может активно и контролируемо перекачиваться (в направлении, показанном стрелкой). Это вызывает принудительную циркуляцию в реакционной камере 149 с потоком реагентной текучей среды по поверхности 103. Таким образом, молекулы 102 постоянно окружены нужными им химическими веществами, в то время как избыток тепла, в частности тепло, генерируемое расщепляющим светом, уносится в сторону от поверхности во избежание перегревания.

Вышеупомянутый избыток тепла, как правило, будет выпущен в окружающую среду с помощью реагентной текучей среды во время ее циркуляции через другие компоненты картриджа. Для того чтобы способствовать этому процессу, может быть предусмотрен охлаждающий элемент 153, действующий в качестве поглотителя тепла. Он может представлять собой, например, область или участок с тесным тепловым контактом с окружающей средой для обеспечения охлаждающего эффекта за счет окружающей атмосферы. В качестве дополнения или альтернативы, охлаждающий элемент 153 может содержать какой-либо блок активного охлаждения, такой как элемент Пельтье.

В предпочтительном варианте осуществления (активная контролируемая) циркуляция реагентной текучей среды с помощью циркуляционного устройства 150 может быть синхронизирована с генерированием тепла на поверхности 103, в частности с облучением расщепляющим светом 112. Активная циркуляция может, например, быть ограничена интервалами деблокирующих УФ-импульсов.

Соответственно, предлагается система секвенирования, в которой секвенирование осуществляется с использованием проволочной сетки в комбинации с циркуляцией буферов, содержащих реагенты, во избежание перегревания системы во время деблокировки с использованием УФ-света.

Фиг.2 показывает устройство 100, которое выполнено с возможностью оптического контроля итерационной ступенчатой реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты с помощью синтеза. Как и на фиг.1, показана подложка 113 в виде проволочной сетки, на которой иммобилизовано, то есть связано, множество молекул 102. Как можно видеть на фиг.2, предусмотрен регулярный рисунок 214 для щелевидных отверстий 215, в которых молекулы 202 связаны на первой поверхности 103. Подложка содержит несколько соседних положений 209, 210, 211 и 212 связывания для связывания молекул на первой поверхности вдоль первого направления 213. Упомянутые положения связывания можно рассматривать как пятна, которые могут быть покрыты клонами идентичных молекул, так что генерируемый оптический сигнал может быть увеличен. При этом подложка 101 обеспечивает матрицу из таких пятен, то есть таких положений связывания, соответственно с различными клонами. Это может увеличивать производительность. Оба устройства 100 по фиг.1 и 2 делают возможным секвенирование нуклеиновой кислоты с помощью только одной жидкости, тем самым избегая необходимости обеспечения этапов промывания, на которых меняют жидкость раствора.

Кроме того, оптическое устройство 104 содержит пять различных источников 201-205 света. Источники 201-204 света можно рассматривать как источники возбуждающего света, для того чтобы обеспечивать четыре различные длины λ_Ex1-λ_Ex4 волн возбуждения, как описано ранее. Источник света 205 обеспечивает расщепляющий свет с длиной волны λ_CL. Например, источник света 205 может испускать УФ-свет. Ссылочная позиция 206 символически изображает переключающее устройство, которое делает возможным переключение оптического устройства 104 между пятью длинами λ_Ex1-λ_Ex4 и λ_CL волн. Кроме того, свет, испускаемый по меньшей мере одним из упомянутых источников 201-205 света, направляют в сторону поляризационного фильтра 200. Кроме того, показано дихроичное зеркало 207, которое передает испускаемый свет источников 201-205 света в направлении подложки 101. После возбуждения флуоресцентной метки нераспространяющейся волной возбуждающего света (по меньшей мере одной из длин λ_Ex1-λ_Ex4 волн), флуоресцентные фотоны, испускаемые флуоресцентной меткой или метками, направляются в сторону дихроичного зеркала 207 и направляются в сторону флуоресцентного детектора 208. Как можно видеть на фиг.2, оптическое устройство 104 может сканировать вдоль направления 213. Соответственно, устройство 100 по фиг.2 выполнено с возможностью осуществления оптического сканирования с помощью перемещения подложки 101 и оптического устройства 104 друг относительно друга вдоль первого направления 213. Соответственно, устройство позволяет осуществлять оптическое сканирование таким образом, что каждое положение связывания, во-первых, облучают возбуждающим светом и затем, во-вторых, облучают расщепляющим светом с длиной волны расщепления при перемещении вдоль первого направления 213. Таким образом, этап деблокировки с использованием расщепляющего света может быть выполнен после считывания флуоресценции возбужденных встроенных нуклеотидов.

Фиг.2 дополнительно показывает циркуляционное устройство 150, как описано выше в отношении фиг.1, которое делает возможной контролируемую циркуляцию реагентной текучей среды через реакционную камеру 149 и по реакционной поверхности с молекулами 102, 209, 210, 211, 212. Следует отметить, что поток реагентной текучей среды может, вообще говоря, иметь любую ориентацию по отношению к проволочной сетке 113. Он может, например, быть параллельным направлению 213, как показано, или перпендикулярным или иметь любую другую ориентацию, удобную в рассматриваемом случае.

Дополнительные подробности и другие примеры устройств и способов могут быть найдены в WO 2013/105025 A1, которая полностью включена в настоящий текст с помощью ссылки.

При том, что настоящее изобретение подробно проиллюстрировано и описано на чертежах и в вышеприведенном описании, такие иллюстрирование и описание следует рассматривать как иллюстративные или типичные, а не ограничивающие; настоящее изобретение не ограничено раскрытыми вариантами осуществления. Специалистами в данной области техники при осуществлении заявляемого изобретения на практике могут быть на основании изучения чертежей, настоящего раскрытия и прилагаемой формулы изобретения придуманы и реализованы другие варианты раскрытых вариантов осуществления. В формуле изобретения слово "содержащий" не исключает других элементов или этапов, и единственное число не исключает множественного. Один процессор или другой блок может выполнять функции нескольких объектов, перечисленных в формуле изобретения. Сам по себе факт, что некоторые величины приведены в попарно различных зависимых пунктах формулы изобретения, не указывает на то, что комбинация данных величин не может применяться для получения преимущества. Компьютерная программа может храниться/распространяться на подходящей среде, такой как оптическая среда для хранения или твердотельная среда, поставляемая вместе с другим аппаратным обеспечением или как его часть, но может также распространяться в других формах, как, например, через интернет или другие проводные или беспроводные телекоммуникационные системы. Никакие ссылочные позиции в формуле изобретения не должны интерпретироваться как ограничивающие объем.