Результат интеллектуальной деятельности: Штамм "АЧС/ВНИИЗЖ/ CV-1" вируса африканской чумы свиней, со сниженной вирулентностью для свиней, для вирусологических, диагностических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности, к штаммам вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве штамма для приготовления специфического антигена, для получения серотипоспецифической сыворотки при проведении вирусологических, диагностических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.

На настоящий момент выделено более 500 штаммов и изолятов вируса африканской чумы свиней, различающихся по культурально-биологическим, молекулярно-генетическим и серологическим свойствам.

Для классификации имеющихся штаммов и изолятов вируса АЧС используют результаты филогенетического анализа нуклеотидной последовательности гена B646L (р72), которые позволили разделить их на 23 генотипа, подразделяющихся на подтипы [13].

Для сероиммунотиповой классификации используют перекрестное заражение свиней и реакцию задержки гемадсорбции (РЗГАд) в культуре клеток костного мозга свиньи (KMC) или альвеолярных макрофагов свиньи (АМС) [3, 15].

Согласно разработанной во ВНИИВВиМ классификации, на настоящий момент изоляты вируса АЧС с четко выраженными антигенными свойствами объединены в девять самостоятельных сероиммунологических типов, в десятую группу включены новые нетипированные изоляты вируса АЧС [5, 6].

Вирус АЧС не встречался на территории Российской Федерации (РФ) до 2007 года, вследствие чего история патентования различных штаммов вируса АЧС в нашей стране начинается с 2010 года, когда был зарегистрирован патент на первый российский штамм АЧС «Ставрополь 01/08». Штамм выделен от свиньи на территории Ставропольского края в 2008 г. Он обладает высокой инфекционной активностью, накапливается в культурах клеток костного мозга свиней и лейкоцитов свиней в титре 6,0-7,0 lg ГАЕ50/см³. Титр вируса на свиньях составляет 7,0-7,5 lg ЛД50/см³. Гибель зараженных свиней наступает с признаками, характерными для острой формы африканской чумы свиней через 3-6 суток после проявления клинических признаков болезни. Летальность достигает 100% [4].

На настоящий момент одновременно отмечается как значительное изменение вирулентности циркулирующего среди диких кабанов вируса и появление животных вирусоносителей, в крови которых выявляются и антитела, и вирусный геном, так и распространение среди домашнего поголовья свиней в ряде областей Сибирского региона высоковирулентного варианта вируса АЧС, близкого по своим характеристикам к изоляту Georgia 2007/1 [7, 10, 12]. Изолят вируса АЧС Georgia 2007/1, исходный вариант вируса, положивший начало эпизоотии в Грузии и сопредельных странах, таких как Армения. По данным В.М. Балышева, а также согласно анализу генома Gallardo С. et al., циркулирующий на территории РФ вирус АЧС относится ко II генотипу VIII серотипу [2, 11, 16].

Вирулентные изоляты и штаммы вируса используются для детального изучения патогенеза болезни, биологических свойств вируса и наработки антигенного сырья при изготовлении диагностических наборов, но они имеют ограниченное использование при получении типоспецифических сывороток. Штаммы вируса АЧС, с отличающимися от изолята Georgia 2007/1 свойствами: вирулентность, контагиозность, выраженность клинических признаков [1], необходимы как для определения основ патогенности вируса АЧС, так и при разработке диагностических препаратов, в том числе на основе гипериммунных сывороток.

Все вышеперечисленные факты делают актуальным получение штаммов со сниженной вирулентностью.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого штамма является естественно аттенуированный изолят OURT88/3, который обладает низкой вирулентностью и индуцирует защиту у животных при контрольном заражении гомологичным вирулентным вирусом. Однако, у некоторых свиней после инокуляции наблюдаются побочные реакции, включая лихорадку и опухлость суставов. Он был выделен более тридцати лет назад, генетически и антигенно отличается отныне существующих вариантов вируса АЧС, циркулирующего на территории Европы. Он принадлежит к I генотипу и IV серотипу, поэтому применение его в дальнейшем в качестве компонента диагностических систем является нецелесообразным [8, 14].

В связи с этим возникла необходимость получить новый, обладающий стабильными культурально-биологическими свойствами, штамм АЧС, адаптированный к росту в перевиваемой культуре клеток CV-1, аттестованной и лицензированной для производства вакцин, т.е. разрешенной для использования в производстве иммунодиагностических и иммунопрофилактических средств и высокой продуктивностью антигена вируса АЧС.

Указанная задача решена путем получения штамма вируса африканской чумы свиней «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1», предназначенного для приготовления антигенсодержащих препаратов при выявлении антител в сыворотках крови домашних и диких животных для диагностики АЧС. Штамм также может быть использован при получении гипериммунной сыворотки для сероиммунотипирования изолятов вируса АЧС в РЗГАд, для определения сероиммунотипа вновь выделяемых природных вариантов вируса АЧС, а также может быть применен в качестве контрольного источника ДНК при проведении апробации тест-систем на основе ПЦР.

Изолят вируса АЧС, послуживший источником для получения штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1», был выделен из селезенки дикого кабана на территории Таракановского лесничества, Одинцовского района, Московской области в 2014 году.

Полученный адаптированный к росту в перевиваемой культуре клеток CV-1 штамм вируса африканской чумы свиней «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером «Штамм вируса африканской чумы свиней - АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1 (диагностический - Д)».

По сравнению с известными штаммами, штамм вируса АЧС «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» обладает способностью к репродукции в культуре клеток почки зеленой мартышки CV-1.

Экспериментально подтверждена возможность использования вируса африканской чумы свиней штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» для накопления и получения специфического культурального антигена с целью проведения диагностических исследований, изучения биологических свойств вируса и получения типоспецифической сыворотки.

Штамм вируса африканской чумы свиней «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» характеризуется следующими признаками и свойствами:

Морфологические свойства.

Штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» вируса африканской чумы свиней относится к семейству Asfarviridae, род Asfivirus. Обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя африканской чумы свиней: при электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают сферические частицы диаметром 185-220 нм.

Наружный слой вириона представлен липопротеидной оболочкой, приобретаемой почкованием в процессе выхода из клетки. Под ней находится икосаэдрический капсид, далее расположена внутренняя липидная оболочка, в которую заключен кор вируса. Кор окружает электронно-плотный нуклеоид, содержащий геном, который представлен двуспиральной, линейной ковалентно замкнутой на концах молекулой ДНК, состоящей из 170-190 тыс. пар нуклеотидов.

Антигенные свойства.

В состав зрелых вирионов вируса АЧС входит более 50 белков. Основные антигенные свойства штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» соответствуют таковым вируса АЧС: штамм обладает гемадсорбирующей активностью, выявляемой в культуре клеток АМС, культуральный антиген, полученный на основании предложенного штамма, взаимодействует со специфическими моноклональными антителами к основному капсидному белку р72.

Вирусспецифические антигены выявляются в иммуноферментном анализе, в реакциях прямой иммунофлуоресценции и задержки гемадсорбции.

Генотаксономическая характеристика.

Методом нуклеотидного секвенирования фрагмента гена B646L штамм вируса африканской чумы свиней «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» отнесен ко II генотипу вируса АЧС.

Генетическая принадлежность изобретения представлена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» с эпизоотическими штаммами вируса африканской чумы свиней II генотипа. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена р72 (B646L).

Сероиммунотиповая принадлежность.

По результатам реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд) с использованием референс-сыворотки к вирусу АЧС штамма «Армения 07», штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1», адаптированный к росту в перевиваемой культуре клеток CV-1, отнесен к вирусу АЧС VIII серотипа. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Культуральные свойства.

Вирус штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» размножается в первичных культурах клеток АМС и KMC, причем, его репродукция сопровождается адсорбцией 10-30 эритроцитов свиней на одну инфицированную клетку (феномен гемадсорбции - ГАд). Накопление вируса на 5-6 сутки составляет 6,5-7,5 lg ГАдЕ50/см³. В течение 5 серийных пассажей (срок наблюдения) штамм сохраняет данные свойства. Основные характеристики вируса АЧС штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» в культурах клеток АМС и CV-1 в процессе пассирования представлены в таблице 1.

С меньшей эффективностью (4,0-5,0 lg ГАдЕ50/см³) вирус штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» размножается в перевиваемых культурах клеток почки поросенка (ППК), тестикул поросенка (ТП), а в клетках почки зеленой мартышки (CV-1) титры накопления вируса достигают значений 6,5-7,0 ГАдЕ50/см³.

Патогенные свойства.

Вирус штамма африканской чумы свиней «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» низкопатогенен для поросят при внутримышечном введении.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и гетерологичными вирусами.

Способ получения и условия хранения.

Штамм хранят при минус 40°С в виде лиофилизированной вируссодержащей суспензии, которую получают путем культивирования вируса в монослое клеток CV-1 при 37°С в течение 5-6 суток и смешивают с равным количеством обезжиренного молока. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.

Дополнительные признаки и свойства.

Вирулентность - вирулентен для 37,5% естественно восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Антигенная активность - введение антигена свиньям индуцирует образование вирусспецифических антител, которые выявляются в иммуноферментном анализе и иммуноблоттинге.

Иммуногенная активность - контрольное заражение выживших свиней позволило определить, что 100% животных приобрели стойкий протективный иммунитет.

Стабильность - стабильно активен при репродукции на первичных (KMC, АМС) и перевиваемой (CV-1) культурах клеток, сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 последовательных пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Изучение репродукционных свойств вируса АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» и его накопление проводили в культуре клеток CV-1 в течение 25 последовательных пассажей. Наличие гемадсорбирующей активности определяли в культуре клеток АМС.

Основные характеристики вируса АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» в культурах клеток АМС и CV-1 в процессе пассирования представлены в таблице 1.

Данные приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что в течение 25 последовательных пассажей вирус штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» стабильно размножался в монослое культуры клеток CV-1 и сохранял способность к репродукции в культуре клеток АМС. Через 7 суток культивирования в культуре клеток CV-1 при температуре 37,0°С накопление вируса составляло 6,0-7,0 lg ГАдЕ 50/см³.

Размножение вируса в культуре клеток АМС сопровождалось феноменом гемадсорбции при внесении в питательную среду 0,01% эритроцитов свиньи.

При исследовании инфекционной активности образца штамма вируса «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» было проведено заражение 8 голов свиней крупной белой породы массой ~ 18 кг/гол. Животных в количестве 6 голов заражали вируссодержащей суспензией внутримышечно в дозе 10 ГАдЕ/гол, а 2 головы оставляли совместно с инфицированными свиньями для контактного заражения.

В ходе эксперимента 3 из 8 зараженных свиней пали с проявлением клинических признаков, характерных для АЧС.

От выживших животных отбирали сыворотку крови, которую исследовали на наличие вирусспецифических антител. В результате проведенной работы была установлена способность штамма вируса «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» вызывать образование выявляемых в ИФА постинфекционных вирусспецифических антител, титры которых достигали 3,101g/см³.

Таким образом, полученный вируссодержащий материал штамма обладает инфекционной активностью для культуры клеток и свиней, а штамм вируса «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» может быть использован при проведении экспериментальных и прикладных научно-исследовательских работ.

Пример 2.

Штамм вируса «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1», благодаря сниженной вирулентности для свиней, имеет преимущества, выраженные в удобстве и быстроте получения типоспецифических сывороток, предназначенных для сероиммунотипирования вновь выделяемых на территории РФ изолятов вируса АЧС.

Для получения типоспецифической сыворотки заражали 6 голов свиней крупной белой породы штаммом «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» вируса АЧС внутримышечно в дозе 10 ГАдЕ/гол, 2 свиньи оставляли совместно с инфицированными животными для контактного заражения.

В ходе эксперимента 5 из 8 свиней выжили. На 45 сутки после первичного внутримышечного введения вируса африканской чумы свиней штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1», выживших свиней повторно заразили в дозе 1000 ГАдЕ/гол высоковирулентным вирусом штамма «Армения 07» II генотипа VIII серотипа. На 38 день после контрольного заражения свиней обескровливали с использованием полого ножа, кровь собрали в стерильные сосуды. После свертывания крови образовавшийся сгусток обводили стерильной спицей, выдерживали при температуре 37°С в течение 1-1,5 часа, для отделения сыворотки.

Затем сыворотку помещали в холодильник и отстаивали 24 ч при +4°С. Далее отделившуюся сыворотку отбирали, дополнительно осветляли центрифугированием при 1000-15000 об/мин в течение 30 мин и расфасовывали по флаконам. Исследование полученных сывороток и определение титра вирусспецифических антител проводили методом ТФ ИФА.

Определение уровня вирусспецифических антител в полученной сыворотке показало, что после контрольного заражения наблюдалось увеличение титра до значений 4,01 lg/см³.

Таким образом, полученная гипериммунная сыворотка содержит специфические к вирусу АЧС антитела и может быть использована в серологических реакциях для диагностических исследований.

Пример 3.

Для определения серотиповой принадлежности штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» в РЗГАд использовали специфическую сыворотку VIII серотипа, полученную к референс-штамму «Армения 07»; специфическую сыворотку VIII серотипа, полученную до контрольного заражения на штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1»; гипериммунную сыворотку VIII серотипа, полученную к штамму «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1»; нормальную сыворотку свиньи (контрольная) и референс-сыворотку CISA INIA (IV серотип), по разработанной во ВНИИВВиМ методике [6].

Первичную культуру клеток (KMC, АМС) выращивали на 96-луночных панелях в посадочной концентрации 6-7×10⁶/мл. После сорбции клеток неприкрепленные клетки и избыток эритроцитов удаляли, а в лунки вносили 200 мкл ростовой среды и инкубировали 48 часов при 37°С и 3-5%CO₂. Реакцию ставили в объеме 250 мкл поддерживающей среды, из которой 200 мкл среда Дюльбекко MEM, 25 мкл вируссодержащей суспензии и 25 мкл специфической или контрольной сыворотки. Учет реакции проводили через 24-72 часа при хорошо выраженной ГАд в контроле. Результаты реакции представлены в таблице 2.

Из результатов, представленных в таблице 2, видно, что специфическая сыворотка, полученная на штамм «Армения 07» вируса АЧС VIII серотипа, вызывала задержку гемадсорбции, в то время, как нормальная сыворотка свиньи и референс-сыворотка CISA INIA (IV серотип) не вызывали задержки появления гемадсорбции.

Таким образом, полученный штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» относится к группе штаммов вируса АЧС VIII серотипа, полученная гипериммунная сыворотка может быть использована для сероиммунотипирования изолятов вируса АЧС в РЗГАд.

Пример 4.

Для изучения возможности использования штамма вируса АЧС «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» при получении специфического культурального антигена для серологических реакций проводили заражение культуры клеток CV-1 указанным штаммом в дозе 10^-3 ГАдЕ 50/см³ на клетку. После появления 40% ЦПД сливали культуральную жидкость и замораживали матрасы с оставшимся монослоем клеток при минус 70°С. После разморозки монослой снимали механическим способом и обмывали поверхность 5 см³ бидистиллированной воды для более полного разрушения клеток и осветляли центрифугированием в течение 30 минут при 3000 об/мин.

Вирус инактивировали добавлением 1% раствора теотропина («А-24») в соотношении 1:100, при экспозиции 12 часов и температуре 4°С.

Клетки, находящиеся в осадке ресуспендировали в 2 см³ дистиллированной воды и обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут трехкратно при частоте звуковой волны 20 кГц.

Для липолиза внутриклеточных комплексов добавляли 1,1,2-трифтортрихлорэтан (фреон-113) в соотношении 1:1, центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут и отбирали водную фазу, которую концентрировали в 5 раз.

Полученным антигеном в разведениях на КББ сенсибилизировали плашки при 4°С в течение 12 часов, и определяли его рабочее разведение в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе (ТФ ИФА) с референс-сывороткой к АЧС CISA INIA в рабочем разведении (1:80) (IV серотип). Результаты, полученные в ходе опыта, представлены в таблице 3.

Результаты исследований, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что полученный диагностический антиген может быть использован для серологических исследований.

При изучении локализации вирусного антигена (штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1») в инфицированных клетках CV-1 получены четкие сигналы иммунофлуоресценции при использовании ФИТЦ-конъюгата моноклональных антител к р72 вируса АЧС (Ингеназа). Наблюдалось характерное флуоресценцентное окрашивание, которое ограничивалась дискретными областями цитоплазмы, соответствующими локализации вирусных фабрик [10].

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» вируса африканской чумы свиней, со сниженной вирулентностью для свиней, для вирусологических, диагностических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований»:

1. Белянин С.А. и др. Патоморфологические изменения у домашних свиней при остром и подостром течении африканской чумы свиней //Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. - 2012. - №. 1.

2. Биологические свойства вируса африканской чумы свиней, выделенного в российской федерации / В.М. Балышев [и др.] // Ветеринария. - 2010. - №7. - С. 25-27.

3. Диагностика африканской чумы свиней. И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, А.Н. Курносов, В.М. Колосов, Ф.А. Бадаев, И.В. Федортщев, В.А. Бурлаков // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - С. 57-70.

4. Патент РФ №2439152, C12N 7/00, G01N 33/53, 30.06.2010

5. Селянинов Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов /Ю.О. Селянинов, В.М. Балышев, С.Ж. Цыбанов / Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - №5. - С. 75-76.

6. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней. И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров и др. // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: материалы науч. - практ. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С. 141-143.

7. Biological characterization of African swine fever (ASF) moderate virulent isolates associated to wild boar cases occurred in Southern Estonia in 2015 / Gallardo C. [et al]. // Workshop on Laboratory Diagnosis and Control of CSF and ASF” // Madrid, Spain- 19h June 2017.

8. Boinas,F.S., Hutchings, G.H., Dixon,L.K., Wilkinson,P.J., 2004. Characterizationof pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus in habiting pig premisesin Portugal.J.Gen.Virol. 85, 2177-2187.

9. Breese, S.S., and C.J. De Boer. 1966. Electron microscope observations of ASFV in tissue culture cells. Virology 28:420-428.

10. Current of ASF situation in Latvia / Cvetkova S. [et al] // Workshop on Laboratory Diagnosis and Control of CSF and ASF. Hannover, Germany, 2016. - P. 11.

11. Gallardo C. [et al]. Genetic Variation among African Swine Fever Genotype II Viruses, Eastern and Central Europe. Emerging Infectious Diseases. 2014; 9:1544-7.

12. Gallardo C. [et al]. Experimental Infection of Domestic Pigs with African Swine Fever Virus Lithuania 2014 Genotype II Field Isolate // Transboundary and Emerging Diseases.

13. Genotyping fielstraing of African swine fever by partial p72 gene characterization. A.D.S. Bastos [et al.] // Arch. Virol - 2003, vol. 148, - P. 693-706.

14. King, K., Chapman,D., Argilaguet,J.M., Fishbourne,E., Hutet,E., Cariolet,R., Hutchings, G., Oura, C.A., Netherton,C.L., Moffat,K., Taylor,G., LePotier, M.F., Dixon,L.K., Takamatsu,H.H., 2011. Protection of European domestic pigs from virulent African isolates of African swine fever virus by experimental immunisation. Vaccine29, 4593-4600.

15. Malmguist W.A. Serologic and immunologic studies with African swine fever virus / W.A. Malmguist // Amer. J. Vet. Res. 1963. - P. 24.

16. Rowlands R. J. et al. African swine fever virus isolate, Georgia, 2007 //Emerging infectious diseases. - 2008. - T. 14. - №. 12. - C. 1870.