Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ГЕНЕ ГАЛАКТОЗО-1-ФОСФАТУРИДИЛТРАНСФЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА МУТАЦИИ Q188R, RS75391579

1. Область техники

Предложенный способ относится к области медицины, биологии и биотехнологии и может быть использован при составлении индивидуального «генетического паспорта», реализации концепции индивидуальной медицины, проведении скрининга на носительство моногенных заболеваний, планировании беременности, неонатальном скрининге. Галактоземия - наследственное заболевание, обусловленное пониженной активностью ферментов участвующих в превращении галактозы в глюкозу. Галактоза поступает в организм с пищей в составе дисахарида - лактозы (молочный сахар). Считают, что патологические повреждения обусловлены накоплением в клетках больных больших количеств галактозо-1-фосфата, что приводит к нарушению клеточного метаболизма. Наибольшие изменения возникают в печени, почках, хрусталике глаза, мозге. Без лечения больные погибают в первые месяцы жизни от инфекций, сепсиса или печеночной недостаточности, у всех больных развивается умственная отсталость с характерными нарушениями речи (хаотичная речь). При раннем назначении диеты дети могут развиться нормально. В основе патогенеза болезни - снижение активности фермента галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы, обусловленное мутациями в гене GALT. В норме фермент катализирует продукцию глюкозо-1-фосфата и уридилдифосфат-галактозы из галактозо-1-фосфат и уридилдифосфат-глюкозы. Галактоземия наследуется по аутосомно-рецессивному типу, в Российской популяции встречается в среднем у 1:20000 новорожденных. Одной из наиболее значимых для Российской популяции является мутация GALT: Q188R (М.И. Яблонская, П.В. Новиков, Т.Э. Боровик и др., 2013; С.А. Матулевич, 2009).

2. Уровень техники

Широко распространен способ определения типа нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР по окончании реакции с помощью электрофореза. При использовании ПЦР с регистрацией результатов в ходе реакции известны различные способы определения генотипа исследуемого образца. Существуют различные способы, позволяющие определить тип нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанные на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР непосредственно в ходе реакции с помощью использования флуоресцентно-меченных проб (олигонуклеотидов) (Andreas R. Tobler at al., "THE SNPlex Genotiping System: A Flexible and Scalable Platform for SNP Genotyping", Journal of Biomolecular Techniques, V. 16, issue 4, Desember 2005). Например, в наборах производства Applied Biosystems используют одну пару праймеров для каждого аллеля и два зонда с различными флуорецентными метками, в зависимости от генотипа аллеля фиксируют разгорание различных меток ("TaqMan SNP Genotyping Assays", Applied Biosistems, Prodakt Bulletin, USA, 06/2006). Недостатком способа, используемого в данных наборах, является сравнительно невысокая достоверность результатов исследования из-за небольшой разницы между получаемыми кривыми флуоресценции для разных аллелей. Предлагаемым подходом к детекции генетического полиморфизма является использование двух аллель-специфичных и меченных разными флуоресцентными метками олигонуклеотидов, а также олигонуклеотида, несущего гаситель флуоресценции и гибридизирующегося на матрицу рядом с аллель-специфичным олигонуклеотидом. Гибридизация аллель-специфичного олигонуклеотида на матрицу ведет к переносу энергии с находящегося на нем флуорофора-донора на гаситель флуоресценции расположенного рядом «гасящего» олигонуклеотида. Регистрацию результатов амплификации ведут по окончании ПЦР путем снятия спектра флуоресценции при изменении температуры реакционной смеси в диапазоне от 25 до 80 градусов по Цельсию (так называемые «кривые плавления»). При получении графиков флуоресценции возможен как нагрев, так и охлаждение реакционной смеси в указанном интервале температур. Предлагаемое изобретение делает определение вариабельных позиций в ДНК более надежным и удешевляет подобные исследования благодаря использованию стандартного оборудования.

В качестве ближайшего аналога заявленных изобретений может быть принят метод детекции мутаций в гене GALT при помощи биочипа для детекции точковых мутаций в гене GALT, описанный в патенте RU 2423521 «Биочип для определения мутаций в гене галактоза-1-фосфат-уридил трансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей». Однако представленное изобретение обладает рядом преимуществ по сравнению с методом, изложенным в RU 2423521.

1. При реализации описанного в патенте RU 2423521 способа детекции точечных мутаций в гене GALT был использован метод гибридизации на биочипах, который более ресурсоемок, чем метод «примыкающих проб». Следовательно, заявленная технология будет более приемлема для использования в рутинной диагностике галактоземии в клинических лабораториях.

2. При реализации описанного в патенте RU 2423521 способа детекции точечных мутаций в гене GALT был использован метод гибридизации на биочипах, при использовании которого вероятность контаминации продуктами амплификации существенно выше, чем при использовании метода «примыкающих проб». Следовательно, заявленная технология будет более приемлема для использования в рутинной диагностике галактоземии в клинических лабораториях.

3. Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение доступности подобных исследований, поскольку способ может быть осуществлен на стандартном известном оборудовании. Также он обеспечивает возможность проводить исследование в одной пробирке, что снижает затраты на исследование. Использованный нами способ генотипирования является вариантом классического метода «примыкающих проб». При определении мутации вначале проводили ПЦР с праймерами, общими для обоих вариантов последовательности, затем температуру реакционной смеси снижали для гибридизации полученной матрицы с олигонуклеотидными пробами. Для определения варианта последовательности использовали два типа олигонуклеотидов, гибридизирующихся на матрицу рядом. Один из олигонуклеотидов метили флуорофором, другой - гасителем флуоресценции. В реакции использовали один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции и пару аллель-специфичных (сиквенс-специфичных) олигонуклеотидов, несущих флуорофор. Олигонуклеотидные пробы, соответствующие тому или иному варианту последовательности, метили различными флуорофорами, что позволило определять оба варианта в одной пробирке. Определение генотипа проводили после ПЦР и гибридизации путем измерения уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Данное измерение проводили в режиме реального времени, его результатом являлись кривые плавления. Условия реакции подбирали так, чтобы максимизировать разницу в температурах плавления совершенного и несовершенного дуплексов. Таким образом, если анализируемый образец содержал только один вариант последовательности, т.е. был гомозиготен по данному варианту последовательности, температура плавления для пробы, образующей совершенный дуплекс была существенно выше, нежели для пробы, образующей несовершенный дуплекс. Если же анализировали гетерозиготный образец, температуры плавления были практически одинаковы. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР флуоресцентно-меченных аллель-специфичных олигонуклеотидных проб и праймеров:

FAM - означает флуоресцентный краситель FAM, HEX - означает флуоресцентный краситель HEX, BHQ1 - означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции.

4. Осуществление изобретения

В качестве материала для исследования рекомендуется использовать периферическую кровь. Выделение ДНК из биоматериала производится с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК (не является предметом данного патента). Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Использовали следующий температурный режим амплификации: 94°С - 10 с, 64°С - 30 с в течение 50 циклов. По завершении реакции амплификации реакционную смесь остужали до 25°С со скоростью 2°С/сек. Кривые плавления получали следующим образом: температуру реакционной смеси повышали с 25°С до 75°C с шагом 1°С, измеряя уровень флуоресценции на каждом шаге (рис 1). Результаты, т.е. отнесение образца к гомозиготе или гетерозиготе по данной мутации, оцениваются по соотношению температур плавления продуктов амплификации и олигонуклеотидных проб меченых тем или иным флуоресцентным красителем (по анализу форм кривых плавления ДНК, а именно по максимуму первой производной графиков флуоресценции), таблица 1. Если анализируемый образец гомозиготен по данному варианту последовательности, температура плавления для пробы образующей совершенный дуплекс существенно выше, нежели для пробы образующей несовершенный дуплекс. В случае гетерозиготного образца температуры плавления практически одинаковы.

Список литературы

1. М.И. Яблонская, П.В. Новиков, Т.Э. Боровик и др.. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению галактоземии // Москва., 2013. - 20 с.

2. Матулевич С.А. Массовый скрининг новорожденных на наследственные болезни обмена как часть системы медико-генетической помощи населению: автореф. дис.д-ра мед. наук. - Москва, 2009. - 44 с.

3. Кофиади И. А., Ребриков Д. В. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой // Генетика. 2006. Т. 42. №1. С. 22-32.