Результат интеллектуальной деятельности: Штамм бактерий Paenibacillus species - продуцент β-глюканазы

Изобретение относится к отрасли микробиологической промышленности, в частности к производству ферментов, и касается нового штамма бактерий, используемого для получения фермента β-глюканазы.

β-глюкан - основной компонент клеточной стенки эндосперма зерновых и представляет собой сложный комплекс плохо усвояемых не крахмальных полисахаридов, который не расщепляется ферментами высших животных и птицы, но легко расщепляются микроорганизмами.

β-глюканазы являются гликолитическими ферментами, расщепляющими некрахмальные полисахариды и воздействующими на 3-4-β-гликозидные связи.

β-глюканазы представляют значительный интерес как компонент кормовых ферментных препаратов, а также для получения глюкозы из природного сырья, содержащего β-глюканы, для разрушения клеточных стенок растений и микроорганизмов с целью более полной экстракции полезных веществ и для утилизации отходов микробиологических производств

Наиболее известны штаммы - продуценты β-глюканаз грибного происхождения.

Так, известен штамм мицелиального гриба Penicillium funiculosum BKM F-3668D (RU 2287570). Однако данный штамм, помимо β-глюканазы, продуцирует ряд других карбогираз, а именно целлюлазу, ксиланазу, пектиназу и маннаназу, что не позволяет использовать этот штамм при производстве моноферментного препарата.

Также известен штамм Trichoderma aureoviride Rifai (RU 2422507), продуцирующий 1,3-β-D-глюканазу. Однако активность фермента, продуцируемого этим штаммом, является очень низкой (13,5-16 ед/мг белка). Недостатком использования этого штамма является также большая продолжительность культивирования (168 часов).

Наиболее близким к заявляемому штамму по технической сущности и достигаемому результату является штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-5790 (Ru 2046141). Штамм продуцирует комплекс гидролитических ферментов, включающий β-глюканазу с активностью 55 ед/мл культуральной жидкости, а также β-глюкозидазу, β-1,4 маннаназу, ксиланазу, α-амилазу, глюкоамилазу. нейтральную, щелочную и кислую протеазу. Из-за большого количества ферментов, штамм В. subtilis ВКПМ В-5790 не может быть использован при производстве моноферментного препарата.

Технической задачей изобретения является расширение арсенала штаммов микроорганизмов продуцирующих β-глюканазу.

Поставленная задача достигается получением бактериального штамма Paenibacillus sp. Bg1 - продуцента фермента β-глюканазы способного продуцировать фермент β-глюканазу с активностью 70 ед/мл культуральной жидкости за 30 часов культивирования, а также использовать β-глюкан как единственный источник углерода.

Заявляемый штамм выделен из почвы лесной зоны Московской области и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (ВКПМ), под регистрационным номером ВКПМ В-13093.

Штамм Paenibacillus sp. Bg1 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки

При росте на агаризованной LB среде (мас.%: дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, агар - 2, вода - остальное) в течение 20 часов при 30°С образует выпуклые прозрачные колонии диаметром 0,5 - 2 мм с неровными краями.

После культивирования в течение 48 часов при 30°С в жидкой среде LB следующего состава (в мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, вода - остальное) штамм образует палочковидные клетки размером 4-5 мкм с эллипсовидной проспорой в раздутом спорангии. Клетки как одиночные, так и собранные в цепочки по 2-4 клетки.

Физиолого-биологические признаки

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях

Штамм Paenibacillus sp. Bg1 способен использовать β-глюкан как единственный источник углерода и продуцировать фермент β-глюканазу с активностью 70 ед/мл культуральной жидкости за 30 часов культивирования.

Оптимальная температура роста - 28-30°С, оптимальный рН - 7.

Штамм хранят в 10% глицерине при - 70°С в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.

В качестве молекулярно-генетической характеристики штамма Paenibacillus sp. Bg1 использованы результаты ПЦР-фингерпринта (Applied and Environmental Microbiology, Oct, 1999, 4351-4356), представленные на фиг. 1.

Фингерпринт проводили методом полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием неспецифических праймеров М13 (линия 2) и 1254 (линия 3).

Праймер М13 gagggtggcggttct

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3 мии.

39 циклов

95°С - 30 сек.

45°С - 30 сек.

72°С - 2 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Праймер 1254 ccgcagccaa

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3 мин.

39 циклов

95°С - 30 сек.

48°С - 30 сек.

72°С - 1 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе использовали молекулярный маркер 1kb DNA GeneRuler (Fermentas) (линия 1, размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.).

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения.

Фиг. 1. Фингерпринт штамма Paenibacillus sp. Bg1

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Продукция β-глюканазы заявляемым штаммом

Для получения посевного материала (инокулята) культуру клеток заявляемого штамма выращивают в жидкой среде LB, следующего состава (в мас.%): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, вода - остальное, в течение 20 ч при 30°С и 250 об/мин.

Количество посевного материала - 5% от объема среды.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл жидкой среды следующего состава (в мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, β-глюкан - 0,5, вода - остальное,

Колбы инкубируют на качалке при 30°С и 200 об/мин, в течение 30 ч. Затем клетки отделяют методом центрифугирования.

Активность β-глюканазы в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять β-глюкан. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 мин при температуре 42°С и рН 6,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих Сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П. Синицын, А.В. Гусаков, И.М. Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с. 144-156).

Активность β-глюканазы составляет 70 ед/мл культуральной жидкости.

Пример 2. Способность заявляемого штамма к использованию β-глюкана в качестве единственного источника углерода

Клетки штамма Paenibacillus sp. Bg1 инкубируют при 30°С на среде следующего состава (в мас.%): NaNO₃ - 0,1, K₂HPO₄ - 0.1, MgSO₄ - 0.05, KCl - 0.1, дрожжевой экстракт - 0,05, β-глюкан - 1, агар - 1.5, вода - остальное. Образование колоний наблюдают через 48 часов.

В используемой среде единственным источником углерода является β-глюкан. Дрожжевой экстракт в количестве 0,05% необходим как источник витаминов и аминокислот.

Таким образом, показано, что штамм Paenibacillus sp. Bg1 ВКПМ В-13093 на полной питательной среде способен продуцировать фермент β-глюканазу с активностью 70 ед/мл культуральной жидкости за 30 часов культивирования и может быть использован при производстве моноферментного препарата.

Важным является также то, что заявляемый штамм может использовать β-глюкан как единственный источник углерода на минимальной среде.