Результат интеллектуальной деятельности: Штамм бактерий Paenibacillus species - продуцент ксиланазы

Изобретение относится к отрасли микробиологической промышленности, в частности к производству ферментов, и касается нового штамма бактерий, используемого для получения фермента ксиланазы.

Ксиланазы расщепляют ксилан - второй по распространенности природный полимер после целлюлозы, он встречается практически во всех растительных тканях. Ксиланазы представляют большой интерес как в промышленном, так и прикладном биотехнологическом аспекте, их широко применяют в пищевой и кормовой промышленности, в бумажной индустрии и процессах отбеливания и других сферах.

Наиболее известны штаммы - продуценты ксиланаз грибного происхождения. Так, известны штаммы грибов Penicillium verruculosum BKM F-3972D (RU 2361918) и штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 (RU 2549706). Однако, эти микроорганизмы, помимо ксиланаз, продуцируют целый комплекс других ферментов: штамм Penicillium verruculosum BKM F-3972D - пектинаы, β-глюканазу и ксилоглюканазы, а штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 - пектиназы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы, что не позволяет использовать эти микроорганизмы при производстве моноферментных препаратов. Недостатками данных штаммов является также большая продолжительность процесса культивирования.

Известны также бактериальные штаммы - продуценты ксиланаз. Так, описан штамм Bacillus macerans bs-04, однако он также, помимо ксиланазы, продуцирует пектиназы, протеазы и амилазы (RU 2272838).

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является штамм Paenibacillus sp. XJ18 (HAYATI Journal of Biosciences January 2015 Vol. 22 No. 1, p 20-26). Однако уровень продукции ксиланзы этим штаммом очень низок (0.0016 U/mL).

Технической задачей изобретения является расширение арсенала штаммов микроорганизмов, продуцирующих ксилиназу.

Поставленная задача решена путем получения бактериального штамма Paenibacillus sp X1 - продуцента фермента ксиланазы, способного продуцировать фермент ксиланзу с активностью 20 ед/мл культуральной жидкости за 30 часов культивирования, а также использовать ксилан как единственный источник углерода.

Заявленный штамм выделен в результате скрининга из почв лесной зоны подмосковья.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (ВКПМ), под регистрационным номером ВКПМ В - 13092.

Штамм Paenibacillus sp. X1 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки

При росте на агаризованной LB среде следующего состава (в мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, агар - 2, вода - остальное) штамм в течение 20 часов при 30°С образует выпуклые прозрачные колонии диаметром 0,3-3 мм с неровными краями.

После культивирования в течение 48 часов при 30°С в жидкой среде LB следующего состава (в мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, вода - остальное), штамм образует палочковидные клетки размером 4-5 мкм с эллипсовидной проспорой в раздутом спорангии. Клетки как одиночные, так и собранные в цепочки по 2-4 клетки.

Физиолого-биологические признаки

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях

Штамм Paenibacillus sp. X1 способен использовать ксилан как единственный источник углерода и продуцировать фермент ксиланазу с активностью 20 ед/мл культуральной жидкости за 30 часов культивирования.

Оптимальная температура роста - 28-30°С, оптимальный рН - 7.

Штамм хранят в 10% глицерине при - 70°С в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.

В качестве молекулярно-генетической характеристики штамма Paenibacillus sp. X1 могут быть использованы результаты ПЦР-фингерпринта (Applied and Environmental Microbiology, Oct, 1999, 4351-4356), представленные на фиг. 1.

Фингерпринт проводили методом полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием неспецифических праймеров М13 (линия 1) и 1254 (линия 2).

Праймер М13 gagggtggcggttct

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3 мин.

39 циклов

95°С - 30 сек.

45°С - 30 сек.

72°С - 2 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Праймер 1254 ccgcagccaa

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3 мин.

39 циклов

95°С - 30 сек.

48°С - 30 сек.

72°С - 1 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер 1kb DNA GeneRuler (Fermentas) (линия 3, размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.).

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения.

Фиг. 1. Фингерпринт штамма Paenibacillus sp. X1

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Продукция ксиланазы заявляемым штаммом

Для получения посевного материала (инокулята) культуру клеток заявляемого штамма выращивают в жидкой среде LB, следующего состава (в мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, вода - остальное, в течение 20 ч при 30°С и 250 об/мин.

Количество посевного материала - 5% от объема среды.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл жидкой среды следующего состава (в мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, ксилан - 0,5, вода - остальное,

Колбы инкубируют на качалке при 30°С и 200 об/мин, в течение 30 ч. Затем клетки отделяют методом центрифугирования.

Активность ксиланазы в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять ксилан. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 мин при температуре 42°С и рН 6,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих Сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П. Синицын, А.В. Гусаков, И.М. Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с. 144-156).

Активность ксиланазы составляет 20 ед/мл культуральной жидкости.

Пример 2 Способность штамма Paenibacillus sp.XI к использованию ксилана в качестве единственного источника углерода

Клетки штамма Paenibacillus sp. X1 инкубируют при 30°С на среде следующего состава (в мас. %): NaNO₃ - 0,1, K₂HPO₄ - 0.1, MgSO₄ - 0.05, KCl - 0.1, дрожжевой экстракт - 0,05, ксилан - 1, агар - 1.5, вода - остальное. Образование колоний наблюдают через 48 часов.

В используемой среде единственным источником углерода является ксилан. Дрожжевой экстракт в количестве 0,05% необходим как источник витаминов и аминокислот.

Таким образом, показано, что штамм Paenibacillus sp. X1 ВКПМ В-13092 на полной питательной среде способен продуцировать фермент ксиланазу с активностью 20 ед/мл культуральной жидкости за 30 часов культивирования и может быть использован при производстве моноферментного препарата.

Важным является также то, что заявляемый штамм может использовать ксилан как единственный источник углерода на минимальной среде.