Производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к производному инсулинотропного пептида, которое модифицировано для повышения его инсулинотропной активности и активности по снижению уровня глюкозы в крови, и к фармацевтической композиции, содержащей данное производное инсулинотропного пептида. Производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что N-концевой заряд инсулинотропного пептида модифицирован до нейтрального или суммарного отрицательного заряда.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Пептиды могут легко денатурировать из-за их низкой стабильности, терять свои активности посредством деградации протеолитическими ферментами in vivo, и являются такими маленькими, что легко выводятся через почки. Соответственно, для того чтобы поддерживать в крови уровни и титры фармацевтического лекарственного средства, содержащего пептид в качестве фармацевтически активного компонента, необходимо часто вводить пептидное лекарственное средство пациенту.

Однако большинство пептидных лекарственных средств вводят в виде инъекционных препаратов, и для поддержания уровня физиологически активных пептидов в крови необходимо частое введение, что вызывает, таким образом, сильную боль у пациентов. Для решения данных проблем предпринимали много усилий для увеличения стабильности пептидных лекарственных средств в крови и для поддержания высокого уровня данных лекарственных средств в крови в течение длительного периода времени, максимизируя таким образом фармацевтическую эффективность лекарственных средств.

В частности, для длительно действующих препаратов таких пептидных лекарственных средств, следовательно, необходимо увеличивать их стабильность при одновременном поддержании их титров на достаточно высоких уровнях, с тем, чтобы не вызывать у пациентов каких-либо иммунных

ответов. В этом отношении, в качестве способов стабилизации пептидов и ингибирования деградации протеолитическим ферментом предпринимали попытки модифицировать специфические аминокислотные

последовательности, которые являются чувствительными к протеолитическим ферментам.

Например, GLP-1 (глюкагон-подобный пептид-1) (7-37 или 7-36 амид), который имеет терапевтический эффект снижения уровня глюкозы в крови для лечения диабета типа 2, имеет короткий физиологический период полувыведения, составляющий примерно 4 минуты или менее из-за потери титров GLP-1 посредством расщепления между 8-ой аминокислотой (Ala) и 9-ой аминокислотой (Aps) дипептидилпептидазой IV (DPP IV). В данном отношении были разработаны производные GLP-1, в которых Ala⁸ заменен Gly, Leu или D-Ala для увеличения устойчивости к DPP IV при поддержании физиологической активности. Кроме того, N-концевая аминокислота GLP-1, His⁷, является критически важной для активности GLP-1 и служит в качестве мишени для DPP IV. Соответственно, N-конец модифицируют до алкильной или ацильной группы, и His⁷ подвергают N-метилированию или альфа-метилированию для увеличения его устойчивости к DPP IV и для поддержания его физиологической активности. Хотя было подтверждено, что стабильность улучшается из-за увеличения их устойчивости к DPP IV, также имелось сообщение о том, что аффинность производных, полученных модификацией His⁷, в отношении рецептора была значительно снижена, и при той же самой концентрации снижалась способность к секреции цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) (см., Gallwitz et al., Regulatory Peptide 79: 93-102, 1999; Gallwitz et al., Regulatory Peptide 86: 103-111, 2000).

Кроме того, среди инсулинотропных пептидов, таких как GLP-1, эксендин-4 содержит последовательность His-Gly вместо His-Ala, которая является последовательностью GLP-1, действующей в качестве субстрата DDP IV. Соответственно, эксендин-4 имеет устойчивость к DDP IV и более высокую физиологическую активность, чем активность GLP-1. Таким образом, эксендин-4 имеет более длительный период полувыведения in vivo, чем период полувыведения GLP-1. Однако, несмотря на то, что период полувыведения in vivo эксендина-4 дольше, чем период полувыведения GLP-1, имеющийся в

продаже эксендин-4 (эксенатид) должен вводиться пациенту дважды в сутки посредством инъекции, и это является большим неудобством для пациентов.

В данных обстоятельствах авторы настоящего изобретения предприняли разнообразные попытки для повышения активностей и стабильности в крови инсулинотропных пептидов и обнаружили, что производные инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом могут демонстрировать превосходные фармакокинетические свойства и более высокие инсулинотропные активности по сравнению с таковыми нативного инсулинотропного пептида, таким образом завершив настоящее изобретение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Задачей настоящего изобретения является предложение производного инсулинотропного пептида, имеющего повышенные инсулинотропные активности и, следовательно, превосходные активности по снижению уровня глюкозы в крови.

Другой задачей настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции для лечения диабета, содержащей указанное выше производное инсулинотропного пептида в качестве активного ингредиента.

Другой задачей настоящего изобретения является предложение способа лечения диабета с использованием указанного выше производного инсулинотропного пептида.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

В одном аспекте для осуществления приведенных выше задач согласно настоящему изобретению предложено производное инсулинотропного пептида, в котором модифицирован N-концевой заряд нативного инсулинотропного пептида.

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложено производное инсулинотропного пептида, в котором N-концевая аминогруппа или N-концевой аминокислотный остаток инсулинотропного пептида модифицированы таким образом, что имеют нейтральный или суммарный отрицательный заряд.

В другом воплощении производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что оно представляет собой

химически модифицированное производное, в котором альфа-аминогруппа N-концевого остатка гистидина инсулинотропного пептида удалена или заменена, или альфа-углерод удален, посредством чего обеспечивается нейтральный или суммарный отрицательный заряд.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что в данное производное введена химическая модификация, соответствующая по меньшей мере одной, выбранной из группы, состоящей из следующих: удаление N-концевой аминогруппы инсулинотропного пептида; замена N-концевой аминогруппы гидроксильной группой; модифицирование N-концевой аминогруппы двумя метильными группами; замена N-концевой аминогруппы карбоксильной группой; удаление альфа-углерода N-концевого остатка гистидина, в результате чего остается только имидазоацетильная группа; и удаление N-концевой аминогруппы при замене С-концевой карбоксильной группы пропиламидом.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что N-концевой остаток гистидина инсулинотропного пептида заменен веществом, выбранным из группы, состоящей из дезаминогистидила, диметилгистидила, бета-гидроксиимидазопропионила, 4-имидазоацетила и бета-карбоксиимидазопропионила.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что N-концевой остаток гистидина инсулинотропного пептида заменен дезаминогистидилом, и С-концевая карбоксильная группа заменена пропиламидом.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что инсулинотропный пептид имеет активность связывания с рецептором GLP.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что инсулинотропный пептид представляет собой GLP-1, представленный SEQ ID NO: 1, эксендин-4, представленный SEQ ID NO: 2, эксендин-3, представленный SEQ ID NO: 3, оксинтомодулин, представленный SEQ ID NO: 5, GIP

(глюкозозависимый инсулинотропный пептид), представленный SEQ ID NO: 6, или их аналог.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что оно имеет более высокое значение константы диссоциации (Kd) от рецептора GLP-1, обусловленное модификацией N-концевого заряда, чем значение константы диссоциации нативного инсулинотропного пептида.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида по настоящему изобретению отличается тем, что N-концевой остаток гистидина GLP-1, эксендина-4, эксендина-3, оксинтомодулина, GIP или их аналога заменен дезаминогистидилом, диметилгистидилом, бета-гидроксиимидазопропионилом, 4-имидазоацетилом или бета-карбоксиимидазопропионилом.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида по настоящему изобретению отличается тем, что N-концевой остаток гистидина GLP-1, эксендина-4, эксендина-3, оксинтомодулина, GIP или их аналога заменен дезаминогистидилом, и С-концевая карбоксильная группа GLP-1, эксендина-4, эксендина-3, оксинтомодулина, GIP или их аналога заменена пропиламидом.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида по настоящему изобретению отличается тем, что оно выбрано из группы, состоящей из следующих: дезаминогистидил-эксендин-4, полученный удалением N-концевой аминогруппы эксендина-4, бета-гидроксиимидазопропионил-эксендин-4, полученный заменой N-концевой аминогруппы эксендина-4 гидроксильной группой; бета-карбоксиимидазопропионил-эксендин-4, полученный заменой N-концевой аминогруппы эксендина-4 карбоксильной группой; диметилгистидил-эксендин-4, полученный модификацией N-концевой аминогруппы эксендина-4 двумя метильными группами; и имидазоацетилил-эксендин-4, полученный удалением альфа-углерода гистидина, который является первой аминокислотой эксендина-4.

В еще одном другом воплощении производное инсулинотропного пептида по настоящему изобретению отличается тем, что оно представляет собой ОА-эксендин-4-пропиламид, полученный удалением N-концевой

аминогруппы эксендина-4 при замене его С-концевой карбоксильной группы пропиламидом.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция для лечения диабета, содержащая в качестве антивного ингредиента производное инсулинотропного пептида, в котором N-концевой заряд инсулинотропного пептида модифицирован, как описано выше.

В еще одном другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ лечения диабета, включающий введение терапевтически эффективного количества производного инсулинотропного пептида, в котором N-концевой заряд модифицирован, как описано выше, субъекту, нуждающемуся в этом.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению может быстро диссоциировать от рецептора GLP-1 из-за модификации N-концевого заряда, чтобы предупредить клиренс инсулинотропного пептида и снизить десенсибилизацию. Также производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению может демонстрировать улучшения инсулинотропной активности и активности по снижению уровня глюкозы в крови in vivo, обусловленные изменениями активности связывания с рецептором GLP-1 по сравнению с таковыми нативного инсулинотропного пептида. Следовательно, производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению может очень эффективно использоваться для лечения диабета.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1а-1г показаны кривые связывания в соответствии с концентрациями производного инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению с рецепторами GLP-1, где на Фиг. 1а представлен нативный эксендин-4, на Фиг. 16 - СА-эксендин-4, на Фиг. 1в - ОА-эксендин-4, на Фиг. 1г - ОА-эксендин-4-пропиламид, и на Фиг. 1д - НУ-эксендин-4.

На Фиг. 2 показан результат измерения инсулинотропной активности нативного эксендина-4 и производного, СА-эксендин-4 с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению.

На Фиг. 3 показан результат измерения активности понижения уровня глюкозы в крови нативного эксендина-4 и производного, СА-эксендина-4 с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению, в диабетических животных моделях.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложено производное инсулинотропного пептида, имеющее модификацию его N-концевого заряда.

Производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается модификацией N-концевого заряда инсулинотропного пептида, посредством которой осуществляется его быстрая диссоциация от рецептора.

Термин «производное инсулинотропного пептида» в том виде, как он здесь используется, относится к производному, в котором N-концевой положительный заряд нативного инсулинотропного пептида, его аналога или его фрагмента модифицирован до нейтрального или суммарного отрицательного заряда посредством химической, генетической или физической манипуляции при сохранении его уникальной инсулинотропной функции.

В частности, производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой производное, в котором N-концевая аминогруппа или N-концевой аминокислотный остаток инсулинотропного пептида химически модифицирован таким образом, что он имеет нейтральный или суммарный отрицательный заряд, и, более предпочтительно, производное, в котором положительный заряд на первом аминокислотном остатке N-конца инсулинотропного пептида модифицирован до нейтрального или суммарного отрицательного заряда.

Термин «инсулинотропный пептид» в том виде, как он здесь используется, относится к пептиду, имеющему инсулинотропную функцию, для стимулирования синтеза и экспрессии инсулина в бета-клетке поджелудочной железы. Для настоящего изобретения можно использовать, без ограничения, любой инсулинотропный пептид при условии, что он демонстрирует физиологическую активность путем связывания с рецептором GLP-1. Их неограничивающие примеры включают GLP-1 (7-37) SEQ ID NO: 1, эксендин-4 SEQ ID NO: 2, эксендин-3 SEQ ID NO: 3, оксинтомодулин SEQ ID NO: 5,

глюкозозависимый инсулинотропный полипептид SEQ ID NO: 6 и их аналог или фрагмент.

Термин «аналог инсулинотропного пептида» в том виде, как он здесь используется, относится к пептиду, в котором по меньшей мере одна аминокислота аминокислотной последовательности нативного инсулинотропного пептида модифицирована, и который имеет инсулинотропную функцию. Предпочтительно термин «аналог инсулинотропного пептида» по настоящему изобретению относится к полипептиду, демонстрирующему по меньшей мере 80%-ную гомологию аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью нативного инсулинотропного пептида, и он может находиться в форме, в которой аминокислотные остатки частично химически замещены (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), удалены (например, дезаминирование) или модифицированы (например, N-метилирование).

В предпочтительном воплощении изобретения аналог инсулинотропного пептида имеет отношение к проявлению эквивалентной или большей инсулинотропной активности по сравнению с инсулинотропной активностью нативного инсулинотропного пептида, но ряд аналогов инсулинотропного пептида по настоящему изобретению не обязательно ограничивается аналогами, имеющими инсулинотропную активность на данном уровне.

Термин «фрагмент инсулинотропного пептида» согласно настоящему изобретению относится к фрагменту, имеющему по меньшей мере одну аминокислоту, добавленную или удаленную на N-конце или С-конце нативного инсулинотропного пептида при сохранении инсулинотропной функции. Добавленная аминокислота может быть аминокислотой, не встречающейся в природе (например, аминокислотой D-типа).

GLP-1 представляет собой гормон, секретируемый тонким кишечником, и обычно он стимулирует биосинтез и секрецию инсулина, ингибирует секрецию глюкагона и стимулирует поглощение глюкозы клетками. В тонком кишечнике предшественник глюкагона распадается на три пептида, т.е. глюкагон, GLP-1 и GLP-2. В описании GLP-1 относится к GLP-1 (1-37), который находится в форме без инсулинотропной функции и подвергается процессингу для того, чтобы стать активной формой GLP-1 (7-37). GLP-1 (7-37) имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.

Предпочтительно аналог GLP-1 может быть выбран из группы, состоящей из: Arg³⁴-GLP-1(7-37), Gly⁸-GLP-1(7-36)-амида, Gly⁸-GLP-1(7-37), Val⁸-GLP-1(7-

1) -амида, Val⁸-GLP-1(7-37), Val⁸Asp²²-GLP-1(7-36)-aмидa, Val⁸Asp²²-GLP-1(7-

2) , Val⁸Glu²²-GLP-1(7-36)-aмидa, Val⁸Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Lys²²-GLP-1(7-36)- амида, Val⁸Lys²²-GLP-1(7-37), Val⁸Arg²²-GLP-1(7-36)-aмидa, Val⁸Arg²²-GLP-1(7-37), Val⁸His²²-GLP-1(7-36)-aмидa, Val⁸His²²-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²Val²⁵-GLP-1(7-37), Val⁸Tyr¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Leu¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Tyr¹⁸Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²His³⁷-GLP-1 (7-37), Val⁸Glu²²lle³³-GLP-1 (7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²Val²⁵lle³³-GLP-1 (7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²lle³³-GLP-1 (7-37), Val⁸Glu²²Val²⁵lle³³-GLP-1 (7-37) иVal⁸Trp¹⁶Glu²²Val²⁵-GLP-1(7-37), но не ограничиваясь ими.

В качестве другого типа инсулинотропного пептида, эксендин-4, представляет собой полипептид, состоящий из 39 аминокислот, который демонстрирует 53%-ное сходство аминокислотной последовательности с GLP-1 и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2. Эксендин-3 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3, и он представляет собой аналог эксендина-4, в котором только аминокислоты в положениях 2 и 3 отличаются от эксендина-4. Эксендин-3 представляет собой эксендин, в котором аминокислоты в положениях 2 и 3 эксендина-4 заменены на серии и аспарагиновую кислоту соответственно, и он может быть представлен какSer²Аsр³эксендин⁴ (1-39). В качестве другого аналога эксендина-4, ZP-10, в котором аминокислоты в положениях 38 и 39 эксендина-4 заменены серином и лизином соответственно, представлен в виде Ser³⁸Lys³⁹-эксендин-4(1-39)-LysLysLysLysLys-aмида и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Оксинтомодулин относится к пептиду, продуцируемому из преглюкагона, который является предшественником глюкагона и высвобождается из L-клеток тонкого кишечника пропорционально поглощению питательных веществ, наряду с GLP-1. Оксинтомодулин представляет собой пептидный гормон, состоящий из 37 аминокислот, представленных SEQ ID NO: 5, и он демонстрирует эффекты ингибирования потребления пищи, усиления насыщения и липолиза глюкагона.

Глюкозозависимый инсулинотропный пептид (GIP) представляет собой инкретин, который регулирует глюкозозависимую секрецию инсулина в

поджелудочной железе в ответ на поглощение питательных веществ в кишечнике. GIP состоит из 42 аминокислот, описанных в SEQ ID NO: 6, и секретируется из клетки К тонкого кишечника. GIP не только стимулирует глюкозозависимую секрецию инсулина, но также стимулирует синтез инсулина, индуцирует пролиферацию β-клеток и ингибирует апоптоз.

Способы, используемые для изготовления нативного инсулинотропного пептида, его аналога или его фрагмента, как описано выше, можно использовать независимо или в их комбинациях. Например, в настоящее изобретение включен инсулинотропный пептид, который отличается по меньшей мере одним аминокислотным остатком аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности нативного инсулина и имеет дезаминирование N-концевого аминокислотного остатка.

В конкретном воплощении нативный инсулинотропный пептид и модифицированное производное инсулинотропного пептида, используемое в настоящем изобретении, могут быть синтезированы посредством протокола твердофазного синтеза, и большинство нативных полипептидов, включая нативный инсулинотропный пептид, также могут быть получены способами генной инженерии.

Термины GLP-1, эксендин-4, эксендин-3, оксинтомодулин или аналог GIP могут относиться к пептиду, в котором по меньшей мере одна аминокислота нативного GLP-1, эксендина-4 или эксендина-3 заменена, удалена и/или добавлена; или по меньшей мере один аминокислотный остаток химически модифицирован, например, посредством алкилирования, ацилирования, этерификации или амидирования, и имеет нативную инсулинотропную активность.

Относительно аналогов GLP-1, эксендина-3 или эксендина-4, в международной публикации WO97/046584 раскрыты аналоги эксендина, в которых С-конец GLP-1 или эксендина-4 частично удален или заменен аминокислотой, не встречающейся в природе, т.е. норлейцином; и в международной публикации WO99/07404 раскрыты соединения-агонисты эксендина с заменой аминокислот эксендина, включающей аминокислоты, не встречающиеся в природе, такие как пентилглицин, гомопролин и трет-бутилглицин; и в публикации заявки на патент США № 2008/0119390 раскрыты соединения-агонисты эксендина, в которых эксендин-4 сконфигурирован так,

чтобы иметь более короткую аминокислотную последовательность, чем эксендин нативного типа или с заменами на другие аминокислоты, полное содержание которых включено сюда посредством ссылки.

Производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что N-концевая аминогруппа или N-концевой аминокислотный остаток нативного инсулинотропного пептида, его аналога или его фрагмента модифицирован так, чтобы иметь нейтральный или общий отрицательный заряд, как описано выше.

Предпочтительно производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению отличается тем, что положительный заряд на первом аминокислотном остатке N-конца инсулинотропного пептида химически модифицирован до нейтрального или суммарного отрицательного заряда.

Производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению, в котором N-концевой положительный заряд инсулинотропного пептида химически модифицирован до нейтрального или суммарного отрицательного заряда, отличается тем, что оно имеет более высокое значение константы диссоциации (Kd) от рецептора GLP-1 по сравнению со значением константы диссоциации нативного инсулинотропного пептида. Производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению модифицировано так, чтобы иметь предпочтительно более чем в два раза, более предпочтительно более чем в три раза и наиболее предпочтительно более чем в шесть раз более высокое значение константы диссциации от рецептора GLP-1 по сравнению со значением константы диссоциации нативного инсулинотропного пептида, но не ограничиваясь ими.

Производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению, в котором N-концевой положительный заряд инсулинотропного пептида модифицирован до нейтрального или суммарного отрицательного заряда, может быть получено разными способами, известными в данной области. Данное производное инсулинотропного пептида может быть модифицировано так, чтобы иметь нейтральный или суммарный отрицательный заряд, посредством удаления или замены альфа-аминоконцевых остатков гистидина или удаления альфа-углерода.

Более предпочтительно, производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению

может включать производное, полученное удалением аминогруппы N-концевого гистидина инсулинотропного пептида (дезаминогистидильное производное), производное, полученное заменой N-концевой аминогруппы гидроксильной группой (бета-гидроксиимидазопропионильное производное), производное, полученное модификацией N-концевой аминогруппы двумя метильными группами (диметилгистидильное производное), производное, полученное заменой N-концевой аминогруппы карбоксильной группой (бета-карбоксиимидазопропионильное производное), или производное, полученное удалением альфа-углерода N-концевого остатка гистидина с оставлением только имидазоацетильной группы (имидазоацетильное производное). Любой вид производного инсулинотропного пептида с модифицированной N-концевой аминогруппой может находиться в пределах объема настоящего изобретения, при условии, что его N-концевой положительный заряд может быть модифицирован до нейтрального или суммарного отрицательного заряда.

Производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом, как описано выше, может быть представлено следующими структурами:

Кроме того, производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению может включать производное, в котором С-концевая карбоксильная группа дезаминогистидильного производного с удалением N-концевой аминогруппы заменена пропиламидом, как описано выше.

Производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом, как описано выше, может быть представлено следующей структурой:

Еще более предпочтительно производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению может представлять собой производное, в котором N-концевой остаток гистидина GLP-1, эксендина-4, эксендина-3, оксинтомодулина, GIP, его аналога или его фрагмента заменен дезаминогистидилом, диметилгистидилом, бета-гидроксиимидазопропионилом, 4-имидазоацетилом или бета-карбоксиимидазопропионилом, посредством чего его N-концевой заряд модифицирован.

В одном аспекте производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению может быть представлено следующей Формулой 1:

в которой R1 выбран из группы, состоящей из дезаминогистидила, диметилгистидила, бета-гидроксиимидазопропионила, 4-имидазоацетила и бета-карбоксиимидазопропионила;

R2 представляет собой -NH2 или -ОН,

X представляет собой Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys- Gly-Arg-Gly;

Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser;

Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-GIn-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; или

Ser-GIn-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-GIn-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-lle-Ala.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения производное инсулинотропного пептида представляет собой производное с модификацией N-концевого заряда эксендина-4, и оно может быть выбрано из группы, состоящей из дезаминогистидил-эксендина-4 (0А-эксендин-4), полученного путем удаления N-концевой аминогруппы эксендина-4; бета-гидроксиимидазопропионил-эксендина-4 (НУ-эксендин-4), полученного путем замены N-концевой аминогруппы эксендина-4 гидроксильной группой; бета-карбоксиимидазопропионил-эксендина-4 (СХ-эксендин-4), полученного путем замены N-концевой аминогруппы эксендина-4 карбоксильной группой; диметил-гистидил-эксендина-4 (ОМ-эксендин-4), полученного путем модификации N-концевой аминогруппы эксендина-4 двумя метильными остатками; и имидазоацетил-эксендина-4 (СА-эксендин-4), полученного путем удаления альфа-углерода гистидина, который является первой аминокислотой эксендина-4.

Кроме того, производное инсулинотропного пептида по настоящему изобретению может представлять собой производное, в котором N-концевой остаток гистидина GLP-1, эксендина-4, эксендина-3, оксинтомодулина, GIP, его аналога или его фрагмента заменен дезаминогистидилом, и его С-концевая карбоксильная группа заменена пропиламидом.

В другом аспекте производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом может включать ОА-эксендин-4-пропиламид, полученный удалением N-концевой аминогруппы эксендина-4 при замене С-концевой карбоксильной группы дезаминогистидил-эксендина-4 (DA-эксендин-4) пропиламидом.

Приведенные выше производные представляют собой производные, в которых альфа-аминогруппа аминоконцевого остатка гистидина удалена или заменена, или удален альфа-углерод. Аминокислотные последовательности не являются конкретно ограниченными, при условии, что сохраняются физиологические активности производных.

Подобно производному эксендина-4, такую замену или удаление можно применять даже к N-концу других типов инсулинотропных пептидов, например, эксендина-3, GLP-1, оксинтомодулина и GIP. Это можно применять даже к их аналогам и их фрагментам, при условии, что сохраняются их инсулинотропные активности.

Производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению может быстро диссоциировать от рецептора GLP-1, таким образом, предотвращая клиренс инсулинотропного пептида и уменьшая десенсибилизацию.

Также производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению демонстрирует повышенную инсулинотропную активность и активность понижения уровня глюкозы в крови in vivo из-за изменения активности связывания с рецептором GLP-1 по сравнению с нативным инсулинотропным пептидом.

Производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению может иметь повышенную инсулинотропную активность по сравнению с нативным инсулинотропным пептидом и демонстрирует превосходную активность понижения уровня глюкозы в крови in vivo, так как N-концевой заряд инсулинотропного пептида изменен на нейтральный или суммарный положительный заряд, что вызывает изменение активности связывания с рецептором GLP-1.

В одном воплощении настоящего изобретения производное инсулинотропного пептида, в котором положительный заряд на N-концевой аминокислоте инсулинотропного пептида модифицирован до нейтрального или суммарного отрицательного заряда, имеет более высокую константу диссоциации (Kd) от рецептора GLP-1, чем Kd нативного инсулинотропного пептида. Соответственно, подтверждено, что частое связывание и диссоциация с рецептором GLP-1 могут повторяться (см. Пример 1). Кроме того, подтверждено, что производное инсулинотропного пептида, в котором N-

концевой заряд инсулинотропного пептида модифицирован, демонстрировало примерно двухкратное увеличение инсулинотропной активности по сравнению с нативным инсулинотропным пептидом, в котором N-концевой заряд инсулинотропного пептида не модифицирован (см. Пример 2). Кроме того, производное инсулинотропного пептида, в котором N-концевой заряд инсулинотропного пептида модифицирован, демонстрировало пятикратное увеличение активности снижения уровня глюкозы в диабетических животных моделях (мыши db/db) по сравнению с нативным инсулинотропным пептидом (см. Пример 3).

Соответственно, можно видеть, что производное инсулинотропного пептида, в котором положительный заряд на N-концевой аминокислоте инсулинотропного пептида модифицирован согласно настоящему изобретению, имеет повышенную константу диссоциации от GLP-1, т.е. увеличение диссоциации от рецептора GLP, таким образом, демонстрируя превосходную стабильность в крови и инсулинотропную активность.

Как описано выше, авторы настоящего изобретения впервые обнаружили, что при модификации N-концевого заряда инсулинотропного пептида до нейтрального или суммарного отрицательного заряда активность связывания с рецептором GLP, в частности диссоциация от приведенного выше рецептора, может быть увеличена, таким образом, приводя к повышенной биологической активности инсулинотропного пептида. Соответственно, превосходная стабильность в крови и инсулинотропная активность производного инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению будут полезными для максимизации эффекта лечения диабета типа 2.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция для лечения диабета, содержащая в качестве активного ингредиента производное инсулинотропного пептида, в котором модифицирован N-концевой заряд.

Описание производного инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом является таким, как описано выше.

Производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению имеет более высокую инсулинотропную активность и активность по снижению уровня глюкозы по сравнению с нативным инсулинотропным пептидом, и, таким образом, его

можно использовать в качестве превосходного терапевтического лекарственного средства для диабета.

Фармацевтические композиции для лечения сахарного диабета согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, для эффективного лечения диабета.

Соответственно, способ лечения диабета у субъекта включает введение терапевтически эффективного количества производного инсулинотропного пептида с модификацией N-концевого заряда, как описано ранее, субъекту, нуждающемуся в этом.

Термин «лечение» в том виде, как он здесь используется, относится ко всем действиям, посредством которых симптомы диабета были улучшены или благоприятным образом модифицированы посредством введения производного инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом или содержащей его фармацевтической композиции.

Термин «введение» в том виде, как он здесь используется, относится к введению заданного количества производного инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом или содержащей его фармацевтической композиции субъекту посредством определенного подходящего способа. Лекарственное средство можно вводить посредством любого обычного пути, при условии, что оно способно достигать желательной ткани. Например, способы введения включают внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, пероральное, местное, интраназальное, внутрилегочное и ректальное введение, но не ограничиваются ими. Однако, поскольку пептиды перевариваются при пероральном введении, композиция для перорального введения должна иметь покрытие или должны быть приготовлена таким образом, чтобы иметь защиту против деградации в желудке. Предпочтительно композицию можно вводить в инъецируемой форме. Кроме того, данную фармацевтическую композицию можно вводить с использованием определенного устройства, способного к транспортировке активных ингредиентов в клетку-мишень.

Кроме того, фармацевтическая композиция, включающая производное по настоящему изобретению, может включать фармацевтически приемлемый носитель. Для перорального введения фармацевтически приемлемый носитель может включать связующее вещество, смазывающее вещество, разрыхлитель,

эксципиент, солюбилизатор, диспергирующий агент, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель, корригент и т.д. Для инъекционных препаратов фармацевтически приемлемый носитель может включать буфер, консервант, анальгетик, солюбилизатор, агент, придающий изотоничность, стабилизатор и тому подобное. Для препаратов для местного введения фармацевтически приемлемый носитель может включать основание, эксципиент, смазывающее вещество, консервант и т.д.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в виде ряда лекарственных форм в комбинации с вышеупомянутыми фармацевтически приемлемыми носителями. Например, для перорального введения фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов или облаток. Для инъекционных препаратов фармацевтическая композиция может быть приготовлена в ампуле в качестве однодозовой формы или в многодозовом контейнере. Фармацевтическая композиция также может быть приготовлена в форме растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул и препаратов длительного действия.

С другой стороны, примеры носителя, эксципиента и разбавителя, подходящих для композиций, могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла. Кроме того, фармацевтические композиции могут дополнительно включать наполнители, антикоагулянты, смазывающие агенты, смачивающие агенты, корригенты и антисептики.

Производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению и содержащую его фармацевтическую композицию вводят в терапевтически эффективном количестве. В настоящем изобретении термин «терапевтически эффективное количество» относится к достаточному количеству для лечения заболевания с приемлемым отношением польза/риск, применимым для медицинского лечения, и уровень эффективного количества может быть определен, в зависимости от факторов, включающих тип заболевания пациента, тяжесть

заболевания, активность лекарственного средства, чувствительность к лекарственному средству, время введения, путь введения, скорость растворения, продолжительность лечения, лекарственное средство, подлежащее одновременному использованию, и элементы, хорошо известные в других областях медицины. Производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению и содержащую его фармацевтическую композицию можно вводить в виде индивидуального терапевтического агента или в комбинации с другим(ми) терапевтическим(и) агентом(ами), или последовательно, или одновременно с традиционным(и) терапевтическим(и) агентом(ами), или оно может быть подвергнуто однократному или многократному введению. Ввиду всех приведенных выше элементов, важно вводить количество, при котором может достигаться максимальный эффект с использованием минимального количества без вредных эффектов, которое может быть легко определено специалистом в данной области.

Частота введения и доза фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению определяются типом заболеваний, подлежащих лечению, путями введения, возрастом пациента, полом, массой тела и тяжестью заболевания, а также типами лекарственного средства в качестве активного компонента. Поскольку фармацевтическая композиция по настоящему изобретению имеет превосходные продолжительности эффективности in vivo и титр, это может значительно уменьшать частоту введения и дозу фармацевтических лекарственных средств.

В настоящем изобретении «субъект» включает людей, обезьян, коров, лошадей, овец, свиней, куриц, индеек, перепелок, кошек, собак, мышей, крыс и морских свинок, но не ограничивается ими. В одном воплощении термин «субъект» относится к млекопитающему, и в другом воплощении термин «субъект» относится к человеку.

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В дальнейшем настоящее изобретение будет более подробно описано со ссылкой на Примеры. Однако данные Примеры предназначены лишь для иллюстративных целей, и подразумевается, что изобретение не ограничивается данными Примерами.

Пример 1: сравнение активности связывания рецептора GLP-1 и производного инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом

Активность связывания рецептора GLP-1 и производного инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом измеряли с использованием установки поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (BIACORE 3000, GE Healthcare). В данном случае в качестве производного инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом использовали СА-эксендин-4, ОА-эксендин-4, НУ-эксендин-4 и DA-эксендин-4-пропиламид.

СА-эксендин-4 представляет собой производное, полученное удалением альфа-углерода N-концевого остатка гистидина эксендина-4; ОА-эксендин-4 представляет собой производное, полученное удалением N-концевой аминогруппы эксендина-4; НУ-эксендин-4 представляет собой производное, полученное заменой N-концевой аминогруппы эксендина-4 гидроксильной группой; и ОА-эксендин-4-пропиламид представляет собой производное, полученное удалением N-концевой аминогруппы эксендина-4 при замене С-концевой карбоксильной группы пропиламидом. Кроме того, в качестве контроля использовали нативный эксендин-4 (эксенатид: Byetta). Производные эксендина-4 с модифицированным N-концевым зарядом были синтезированы American Peptide Corporation, и нативный эксендин-4 был получен от Amylin Pharmaceuticals.

Рецептор GLP-1 экспрессировали из клеток СНО(яичники китайского xoMAKa)-DG44 в форме hGLP-1 R/GST. Экспрессируемый hGLP-1 R/GST иммобилизовали на чипе СМ5 посредством аминного связывания. К чипу СМ5 с иммобилизованным hGLP-1 R/GST затем добавляли производные инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом, разведенные до необходимой концентрации, для определения активности связывания с рецептором GLP-1. Активность связывания между производными инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом и рецептором анализировали согласно модели аппроксимации Ленгмюра 1:1, и результаты показаны на Фиг. 1а-1д и в Таблице 1, приведенной ниже.

Как показано в Таблице 1 и на Фиг. 1а-1д, подтвердили, что N-конец нативного эксендина-4 имеет положительный заряд, тогда как производные эксендина-4, где этот заряд изменен до нейтрального заряда, демонстрировали значительно увеличенную константу диссоциации (kd). Данные результаты показывают, что между рецептором GLP-1 и производным инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом могут многократно происходить более частое связывание/диссоциация.

Данные фармакокинетические изменения рецептора GLP-1 могут предотвращать клиренс производного инсулинотропного пептида посредством рецептора и делать менее вероятным проявление десенсибилизации. Следовательно, производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом является полезным для увеличения стабильности в крови.

Пример 2: измерение инсулинотропной активности производного инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом

Инсулинотропные активности производных инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом сравнивали в клетках RINm5F. Клетки RINm5F оттаивали и субкультивировали по меньшей мере один раз, с последующей инокуляцией в 96-луночный планшет в плотности 1 х 10⁵ клеток/лунку с культуральной средой, содержащей FBS (фетальная телячья сыворотка) (Gibco, #11082). Затем клетки культивировали в инкубаторе с 5% СОг при 37°С в течение 48 часов. Для измерения инсулинотропных активностей культуральную среду клеток RINm5F заменяли свежей средой, содержащей 0,5% FBS, и затем инкубировали в течение 1 часа.

Каждое из производных инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом и нативный эксендин-4 (эксенатид: Byetta) разводили культуральной средой, содержащей 0,5% FBS и глюкозу, с получением

концентраций от 10 нМ до 0,001 нМ. В это время культуральную среду, не содержащую эксендин-4, использовали в качестве контрольной группы. Культуральную среду клеток RINm5F удаляли, и добавляли к ним приготовленные образцы, с последующим культивированием в инкубаторе с 5% СОг при 37°С в течение 1 часа. Затем из каждой лунки выделяли среду. Для определения концентраций инсулина выделенной среды использовали набор ELISA (твердофазный иммуноферметный анализ) для крысиного инсулина (Mercodia), и результаты показаны на Фиг. 2 и в Таблице 2.

Как показано в Таблице 2 и на Фиг. 2, обнаружили, что производные инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению демонстрировали примерно в 1,25 раза большую инсулинотропную активность, чем нативный эксендин-4 в таком же интервале концентрации.

Пример 3. Сравнение эффективности in vivo производного инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом

Для измерения эффективности in vivo производных инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом измеряли их эффект на понижение уровня глюкозы в крови в диабетической животной модели, по сравнению с нативным эксендином-4. Мышей db/db (Jackson Lab, 10-12-недельных) заставляли голодать в течение 2 часов, и затем вводили производные инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом и эксендин-4 (эксенатид: Byetta) в количестве 0,01-1000 мкг/кг посредством подкожного пути соответственно. В данное время аналогичным образом вводили носитель в качестве контрольной группы, и % изменения уровня глюкозы в крови относительно носителя рассчитывали при каждой концентрации. Через 1 час отбирали образцы крови из хвостового кровеносного сосуда для измерения уровней глюкозы в крови с использованием глюкометра. При каждой концентрации рассчитывали ED50 (50%-ная эффективная доза) для

эффекта снижения уровня глюкозы в крови относительно носителя с использованием программы Prism.

Как показано в Таблице 3 и на Фиг. 3, обнаружили, что производные инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению демонстрировали примерно в 5 раз больший эффект снижения уровня глюкозы в крови, чем нативный эксендин-4, в диабетической животной модели.

Из вышеописанных результатов можно видеть, что производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению может быстро диссоциировать от рецептора GLP-1 из-за увеличения константы диссоциации с GLP-1 и, таким образом, демонстрирует стабильность в крови, вызывая повышенные инсулинотропную активность и эффект снижения уровня глюкозы в крови. Следовательно, производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению можно очень эффективно использовать для лечения диабета.

На основе приведенного выше описания специалистам в данной области будет понятно, что настоящее изобретение можно осуществлять в разной конкретной форме без изменения его технической сущности или существенных характеристик. Следовательно, следует понимать, что приведенное выше воплощение не является ограничивающим, но во всех аспектах иллюстративным, и что подразумевается, что все изменения и модификации, которые получены из объекта изобретения, определенного в формуле изобретения или ее эквивалентах, охватываются в объеме настоящего изобретения.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению может быстро диссоциировать от рецептора GLP-1, и, таким образом, это может предотвращать клиренс инсулинотропного пептида и с меньшей вероятностью вызывать десенсибилизацию. Также производное инсулинотропного пептида с модифицированным N-концевым зарядом согласно настоящему изобретению демонстрирует повышенную инсулинотропную активность и эффект снижения уровня глюкозы в крови in vivo из-за изменения активности связывания с рецептором GLP-1 по сравнению с нативным инсулинотропным пептидом. Следовательно, производное инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению можно очень эффективно использовать для лечения диабета.