СПОСОБ ОПТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ПАТОЛОГИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ

Изобретение относится к области медицины, онкологии и может быть использовано для диагностики возникновения злокачественных новообразований в тканях.

В ткань вводят экзогенные молекулы - зонды. Такими зондами могут служить молекулы органических красителей, способные излучать замедленную флуоресценцию (ЗФ) и фосфоресценцию. Затем введенные в ткань молекулы возбуждают импульсами лазерного излучения в основной полосе поглощения S₀→S₁, где S₀ - основное состояние молекулы, S₁ - первое возбужденное синглетное состояние. В результате интеркомбинационной конверсии S₁→Т₁ из первого возбужденного синглетного состояния, появляются молекулы красителей в триплетном T₁ состоянии (которые характеризуются большими значениями времени жизни 10^-6 - 10^-3 с). Триплетные состояния молекул эффективно тушатся молекулярным кислородом ³О₂ с образованием синглетного кислорода ¹О₂.

В работе [«Журнал физической химии», 2013, том. 87, №9, с. 1602-1607] показано, что в биотканях в присутствии синглетного и молекулярного кислорода возможны следующие каналы релаксации триплетных состояний молекул:

- термоинициированная обратная T₁→S₁ интеркомбинационная конверсия с последующей замедленной флуоресценцией T₁→S₁→S₀+hν_ЗФ (в дальнейшем будем называть этот тип замедленной флуоресценции - ТЗФ);

- синглет-триплетная аннигиляция T₁+¹O₂, сопровождающаяся возникновением S₁ состояний молекул с последующей замедленной флуоресценцией T₁+¹О₂→³О₂+S₁→S₀+hν_ЗФ (в дальнейшем будем называть этот тип замедленной флуоресценции - СТА ЗФ);

- фосфоресценция T₁→S₀+hν_ФОС.

Авторами настоящей заявки ["Вестник ОГУ", 2015, №13, С. 175-180; Journal of Photochemistry & Photobiology, В: Biology 163 (2016) 232-236] показано, что в злокачественных опухолях, в отличие от нормальных тканей, при импульсно-периодическом возбуждении, из-за разности скоростей расходования фотосенсибилизированного синглетного ¹О₂ кислорода внутри ткани и поступления ³О₂ кислорода из внешней среды в ткань в промежутке между возбуждающими импульсами, наблюдается эффект тушения СТА ЗФ. В работе ["Вестник ОГУ", 2015, №13, С. 175-1802] этот эффект предложено использовать для диагностики возникновения опухолей на ранней стадии.

Интегральный измеряемый сигнал замедленной флуоресценции зондов в биотканях представляет собой суперпозицию двух типов свечения - ТЗФ и СТА ЗФ. Интенсивность замедленной флуоресценции I_ЗФ (площадь под кинетической кривой ЗФ) определяется выражением:

где А₁ и А₂ - постоянные коэффициенты;

n_Δ(t) - концентрация синглетного кислорода;

n_T(t) - концентрация зондов в триплетном состоянии.

Первое слагаемое в (1) представляет вклад СТА ЗФ в общий сигнал, второе - вклад ТЗФ.

Тушение СТА ЗФ в опухолях происходит потому, что при возбуждении в строб-режиме для каждого последующего импульса концентрация молекул кислорода в ткани оказывается меньшей, чем для предыдущего импульса. Уменьшение концентрации кислорода в ткани влечет за собой уменьшение

величины n_Δ(t) в выражении (1) и, как следствие, уменьшение вклада первого слагаемого в общий сигнал ЗФ.

Другой причиной тушения ЗФ может быть фотохимическое обесчвечивание красителей в тканях при лазерном возбуждении, т.е. уменьшение величины n_T(t) в выражении (1). Для учета возможной фотохимической деградации красителей предлагается при каждом отдельном измерении кинетики ЗФ зондов одновременно измерять кинетику их фосфоресценции.

Интенсивность фосфоресценции I_Ф0С равна:

где A₃ - постоянный коэффициент.

Измерения фосфоресценции зондов позволяет контролировать изменение величины n_T(t). Практически эта задача решается введением в установку дополнительного фотоприемника, регистрирующего свечение в спектральном диапазоне, соответсвующем фосфоресценции зондов. Величина разностного интегрального сигнала фосфоресценции, определяемого во временном интервале 0-15 мкс, добавляется к интегральному сигналу замедленной флуорисценции. Врезультате описаной процедцры получаем скорректированные данные о кинетике СТА ЗФ, что повышает достоверность процедуры диагностики паталогии биологических тканей.

Ближайшим по техническому решению к предлагаемому способу является способ определения патологий в биологических тканях на основе измерения тушения СТА ЗФ молекулярных зондов в тканях в режиме импульсно-периодического возбуждения [Journal of Photochemistry & Photobiology, В: Biology, 163, 2016, 232-236]. Недостатком способа является отсутствие контроля изменения концентрации триплетных состояний фотосенсибилизаторов (зондов) после каждого возбуждающего импульса, что вносит неточность в интерпретацию результатов измерений.

Техническим результатом изобретения является повышение точности и обеспечение корректности способа диагностики онкологических заболеваний основанного на тушении замедленной флуоресценции зондов при импульсно-периодическом возбуждении, путем создания возможности контроля изменения концентрации триплетных состояний молекул зондов непосредственно в процессе измерения кинетики затухания замедленной флуоресценции. Задача решается тем, что в экспериментальную установку вводится дополнительный канал регистрации свечения и одновременно с замедленной флуоресценцией измеряется кинетика фосфоресценции молекулярных зондов после каждого возбуждающего импульса. По изменениям, происходящим в кинетике фосфоресценции, контролируется концентрация триплетных состояний молекул зондов в ткани и производится (при необходимости) корректировка данных измерений кинетики замедленной флуоресценции.

Реализация способа оптической диагностики патологий в биологических тканях с одновременным контролем концентрации триплетных состояний молекул зондов непосредственно в процессе измерения кинетики затухания замедленной флуоресценции приведена в следующем примере.

Измерения проводились in vitro в тканях здоровых и больных раком молочной железы мышей линии BYRB и раком желудка крыс линии Wistar. Образцы тканей окрашивались ксантеновыми красителями (молекулярными зондами, фотосенсибилизаторами) - эритрозином, эозином или бенгальским розовым и подвергались облучению серией лазерных импульсов с плотностью мощности 0,5 МВт/см² и длительностью импульса 15 нс. Импульсы следовали через равные промежутки времени в 200 мс. Обычно в серии было от 5 до 7 импульсов. После каждого импульса измерялись кинетические кривые замедленной флуоресценции (λ_max=570 нм) и фосфоресценции (λ_max=680 нм).

На фиг. 1а приведены кинетические кривые ЗФ, а на фиг. 1б кинетические кривые фосфоресценции эритрозина, измеренные после первого (линия 1) и седьмого (линия 2) импульсов возбуждения. Видно, что после седьмого импульса наблюдается заметное тушение СТА ЗФ, что свидетельствует о наличии патологии в исследуемом образце ткани.

Для контроля концентрации триплетных состояний молекулярных зондов осуществляли измерение кинетики фосфоресценции. На фиг. 1б видно, что интенсивность фосфоресценции фотосенсибилизатора (эритрозина) при выбранном режиме облучения во временном интервале 0-15 мкс не изменяется, что свидетельствует об отсутствии фотохимической деградации красителя.

На фиг. 2 представлены кинетические кривые замедленной флуоресценции и фосфоресценции красителя бенгальского розового в злокачественной опухоли ткани желудка крысы линии Wistar. На фиг. 2а видно, что имеет место сильное тушение ЗФ бенгальского розового. Это свидетельствует о возможном наличии в исследуемой ткани патологии.

Однако измерения кинетики фосфоресценции красителя показывают, что от импульса к импульсу происходит уменьшение интенсивности фосфоресценции. На фиг. 2б приведены кинетические кривые после 1-го и после 7-го импульсов. Этот результат указывает на то, что имеет место фотохимическая деградация фотосенсибилизатора, которая также приводит к уменьшению интенсивности ЗФ бенгальского розового.

В данном случае, для корректной диагностики наличия патологии в исследуемой ткани, следует скорректировать кинетическую кривую ЗФ путем учета фотохимических процессов. Результаты процедуры корректировки показаны на фиг. 3. Здесь приведена гистограмма сравнительных изменений интенсивности замедленной флуоресценции и фосфоресценции бенгальского розового, внедренного в ткани желудка больной и здоровой крысы линии Wistar при импульсно-периодическом возбуждении с частотой 5 Гц (гистограмма построена по площади под кинетическими кривыми, регистрируемыми после каждого импульса во временном интервале 0-15 мкс). По оси абсцисс отложен порядковый номер возбуждающего импульса.

Ряд 1 - интегральная интенсивность ЗФ бенгальского розового в ткани здоровой крысы (небольшое уменьшение интенсивности ЗФ обусловлено фотохимической деградацией красителя);

Ряд 2 - интегральная интенсивность ЗФ бенгальского розового в ткани больной крысы (без учета фотохимической деградации красителя);

Ряд 3 - интенсивность СТА ЗФ бенгальского розового в ткани больной крысы с учетом фотохимической деградации красителя.

Из фиг. 3 видно, что к седьмому импульсу интенсивность сигналов СТА ЗФ (Ряд 3) красителя, внедренного в испытуемую ткань желудка, уменьшается на 60%, что надежно и достоверно свидетельствует о наличии в ней патологии.