Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МЕГАКАРИОЦИТАРНОГО РОСТКА КОСТНОГО МОЗГА

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, цитологии, патоморфологии и может быть использовано как способ оценки метаболической активности мегакариоцитарного ростка костного мозга.

Известен способ оценки активности мегакариоцитарного ростка костного мозга по определению количества тромбоцитов, основанного на использовании кондуктометрического метода автоматических гематологических анализаторов, связанного с измерением величины электрического импульса, возникающего как результат изменения сопротивления между двумя электродами трансдьюсера, при прохождении через них клеток крови. Недостатком данного способа является исследование периферической крови без учета интенсивности обмена и микроокружения костного мозга, ориентировка только на количественные характеристики тромбоцитов и косвенность полученных данных. Так же существуют трудности при дифференцировке макротромбоцитов, эритроцитов с малым объемом и их фрагментов (шизоцитов) и др., что приводит к искажению количества тромбоцитов. [1].

Существует способ определения способности клеток костного мозга к делению [2] и активности клеток костного мозга [3], заключающийся в исследовании флуоресценции ядросодержащих клеток костного мозга, обработанных иодид 2-(n-диметиламиностирил)-1-метилпиридинием. Общими недостатками последних двух способов являются комплексная оценка пролиферативного потенциала костного мозга, без разделения на разные клеточные линии и невозможности оценки состояния мегакариоцитарного ростка. Следует отметить, что в данных способах отсутствует стандартизация условий проведения исследования, так как в исследуемом материале в силу разного возраста, пола и состояния исходно неодинаковое количество ростовых факторов.

В качестве аналога можно использовать публикацию Л.П. Тер-Татевосян и др. [4] в которой изучали влияние обогащенного пролином полипептида PRP-1 на активность ферментов углеводно-фосфорного обмена у интактных крыс и крыс, подвергнутых фармакологической десимпатизации 6-гидроксидофамином (6-OHDA) (40 мг/кг) в гомогенатах костного мозга и селезенки. В этом способе на холоде извлекали костный мозг, селезенку и готовили гомогенат на физиологическом растворе. В полученных гомогенатах определяли активность щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы и гликогенфосфорилазы. Существенным недостатком является то, что изучают гомогенат костного мозга, при получении которого разрушаются и лизосомы, протеазы которых способны разрушить ферменты других видов обмена и исказить результаты.

Известен способ количественной оценки мегакариоцитарного ростка костного мозга, основанный на подсчете количества мегакариоцитов в камере Фукса-Розенталя [5]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, неточность, так как часто пропускаются мелкие, молодые формы мегакариоцитов, а также высока вероятность принятия других крупных клеток костного мозга, таких как остеокласты, многоядерные плазматические клетки, крупные макрофаги и др., за мегакариоциты. Данный способ принят за прототип [5].

Целью изобретения является разработка способа оценки метаболической активности мегакариоцитарного ростка костного мозга.

Эта цель достигается тем, что исследуют полученный стандартным методом аспират костного мозга в объеме 0,3-0,5 мл, который переносят в пробирку с ЭДТА, пробирку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут, далее отбирают бесклеточную миелоплазму в объеме 250-400 мкл и проводят ее биохимическое исследование с определением активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы методами, рекомендуемыми IFCC; рассчитывают показатель метаболической активности мегакариоцитарного ростка (ПМАМ) по формуле: ПМАМ=А*100/В+С, где А - количество мегакариоцитов в 1 мкл костного мозга; В - активность аланинаминотрансферазы в миелоплазме, Е/л; С - активность аспартатаминотрансферазы в миелоплазме, Е/л; ПМАМ<10,9 свидетельствует о снижении метаболической активности мегакариоцитарного ростка костного мозга; ПМАМ>15,9 свидетельствует о высокой метаболической активности мегакариоцитарного ростка костного мозга; ПМАМ от 10,9 до 15,9 свидетельствует о нормальной метаболической активности мегакариоцитарного ростка костного мозга. Способ позволяет быстро, просто оценить метаболическую активность мегакариоцитарного ростка.

Способ реализуют следующим способом: исследуют полученный стандартным методом аспират костного мозга в объеме 0,3-0,5 мл, который переносят в пробирку с ЭДТА, пробирку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут, далее отбирают бесклеточную миелоплазму в объеме 250-400 мкл и проводят ее биохимическое исследование с определением активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы методами, рекомендуемыми IFCC, а именно без использования кофермента пиридоксальфосфат; рассчитывают показатель метаболической активности мегакариоцитарного ростка (ПМАМ) по формуле: ПМАМ=А*100/В+С, где А - количество мегакариоцитов в 1 мкл костного мозга; В - активность аланинаминотрансферазы в миелоплазме, Е/л; С - активность аспартатаминотрансферазы в миелоплазме, Е/л; ПМАМ<10,9 свидетельствует о снижении метаболической активности мегакариоцитарного ростка костного мозга; ПМАМ>15,9 свидетельствует о высокой метаболической активности мегакариоцитарного ростка костного мозга; ПМАМ от 10,9 до 15,9 свидетельствует о нормальной метаболической активности мегакариоцитарного ростка костного мозга.

Для того чтобы разработать критерий оценки метаболической активности мегакариоцитарного ростка были проанализированы образцы периферической крови и костного мозга у 128 больных с впервые выявленной идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (ИТП). Известно много гематологических заболеваний, связанных с патологией мегакариоцитарного ростка. И у большинства из них происходит изменение и других ростков кроветворения. Как мы видим из приложения №1 таблицы №1 «Показатели миелограммы у пациентов с ИТП», установлено, что у всех пациентов с ИТП достоверно увеличено количество мегакариоцитов в среднем до 154,4±23,3×10⁶/л, тогда как другие ростки кроветворения остались без изменений. Именно поэтому для выведения критерия оценки метаболической активности мегакариоцитарного ростка нами была выбрана группа пациентов с ИТП.

Среди обследуемой группы 79 женщин и 43 мужчин в возрасте от 19 до 88 лет (медиана - 55). Критериями исключения служили наличие заболеваний, которые могут привести к тромбоцитопении (вирусные гепатиты, коллагенозы и др.), а также сочетание ИТП с анемиями, так как при этом наблюдаются изменения не только мегакариоцитарного, но и эритроидного ростков костного мозга [6]. Обследование больных включало общепринятый в гематологии перечень: клинический осмотр, общий анализ крови, биохимический анализ, миелограмма, и в дополнение биохимическое исследование миелоплазмы. Активность аланинаминотрансферазы (АЛАТ) и аспартатаминотрансферазы (АСАТ) определяли методами, рекомендуемыми IFCC (Международной Федерации Клинической Химии и Лабораторной Медицины). Данная группа методов в составе диагностического набора не использует кофермент пиридоксальфосфат. Поскольку методы, рекомендованные IFCC, более распространены в применении в современных лабораториях, они и были выбраны нами для данного исследования. Число тромбоцитов в периферической крови у данных пациентов было менее 100*10⁹/л и составило в среднем 40,7±3,1*10⁹/л. Полученные результаты обрабатывали с использованием пакета программ STATISTICA (ver. 6.0). Определяли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (m; различия между группами оценивали с помощью t - критерия Стьюдента и U-критерий Манна-Уитни, и различия считали значимыми при р<0,05. Результаты исследования миелоплазмы приведены в приложении №2 таблице №2 «Показатели биохимического исследования миелоплазмы у пациентов с ИТП». Установлено достоверное снижение активности аланинаминотрансферазы до 13,8±4,5 Е/л и аспартатаминотрансферазы до 36,41±6,89 Е/л у пациентов с ИТП.

При проведении корреляционного анализа между количеством мегакариоцитов в костном мозге и ферментами в миелоплазме выявлена высокая степень обратной взаимосвязи с аланинаминотрансферазой (r=-0,728) и с аспартатаминотрансферазой (r=-0,743). То есть, доказано, что существует тесная связь процессов трансаминирования с количеством мегакариоцитов.

Основываясь на выявленной корреляции, эмпирическим путем был разработан показатель метаболической активности мегакариоцитарного ростка (ПМАМ), который рассчитывается по формуле:

ПМАМ=А* 100/В+С, где

А - количество мегакариоцитов в 1 мкл костного мозга;

В - активность аланинаминотрансферазы в миелоплазме, Е/л;

С - активность аспартатаминотрансферазы в миелоплазме, Е/л.

Нами было определено, что в норме значения данного показателя колеблются в диапазоне 10,9-15,9. Таким образом, получение результата ниже 10,9 говорит о сниженной метаболической активности мегакариоцитарного ростка, а получение результата выше 15,9 говорит наоборот о высокой метаболической активности мегакариоцитарного ростка.

Способ иллюстрируется клиническими примерами.

Пример 1.

Пациентка К., 52 года, поступила в стационар с количеством тромбоцитов в общем анализе крови 14×10⁹/л. При подсчете миелограммы обнаружено расширение мегакариоцитарного ростка - количество мегакариоцитов 157×10⁶/л. Клеточность костного мозга - 112×10⁹/л. Пациентке был выставлен диагноз «идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура» (ИТП). При исследовании миелоплазмы предлагаемым способом активность АЛАТ оказалась 12,8 Ед/л, ACAT - 40,4 Ед/л. Далее рассчитывался ПМАМ, который оказался равным 2951,12. Таким образом, можно отметить, что в данном случае наблюдается высокая метаболическая активность мегакариоцитарного ростка.

Пример 2.

Пунктат костного мозга донора при исследовании содержал количество мегакариоцитов 73,9×10⁶/л, клеточность костного мозга - 124×10⁹/л. При исследовании миелоплазмы предлагаемым способом активность АЛАТ оказалась 259,8 Ед/л, АСАТ - 269,4 Ед/л. Далее рассчитывался ПМАМ, который оказался равным 13,9. Таким образом, можно отметить, что в данном случае наблюдается нормальная метаболическая активность мегакариоцитарного ростка.

Пример 3.

Пациентка Р., 49 лет, поступила в стационар с количеством тромбоцитов в общем анализе крови, которое составило 28×109/л. Количество мегакариоцитов в костном мозге - 17×106/л. Клеточность костного мозга равна 49,8×109/л. После дообследования был выставлен диагноз «апластическая анемия». При исследовании миелоплазмы предлагаемым способом активность АЛАТ оказалась 125,6 Ед/л, АСАТ - 274,0 Ед/л. Далее рассчитывался ПМАМ, который оказался равным 4,25. Таким образом, можно заключить, что в данном случае отмечается низкая метаболическая активность мегакариоцитарного ростка. Способ позволяет быстро, просто оценить метаболическую активность мегакариоцитарного ростка. Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, цитологии, патоморфологии.

Источники информации

1. Патент на изобретение RU №2289133

2. Патент на изобретение № RU 2537141

3. Патент на изобретение RU №2488826

4. Тер-Татевосян Л.П., Саркисян Л.В., Ераносян Л.А. и др. Ферменты углеводно-фосфорного обмена в костном мозге и селезенке при десимпатизации. Эффекты нейропептида PRP-1 // Нейрохимия.- 2009.- т. 26, №4.- С. 333-336.

5. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е.А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.

6. Evstatiev R., Bukaty A., Jimenez K. et al. Iron deficiency alters megakaryopoiesis and platelet phenotype independent of thrombopoietin // Am. J. Hematol.- 2014.- Vol. 89.- P. 524-529.

Примечание: * отличие от нормы с уровнем достоверности р<0,005.

Примечание: * - отличие от нормы с уровнем достоверности р<0,005.