Способ выделения ДНК из растений, пригодный для постановки ПЦР

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно, к методам выделения ДНК из растений. Может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для выделения ДНК из растений с преимущественно высоким содержанием неповрежденной ядерной ДНК с целью последующей ПЦР-амплификации специфического участка изолированной ДНК.

Известные способы

1) Способ выделения НК с использованием сорбента[1]. Принцип метода заключается в обработке биологического материла хаотропными агентами - высококонцентрированными растворами в присутствии суспензии силики (двуокись кремния). Хаотропный агент растворяет клетки и вирусные частицы, приводя к высвобождению нуклеиновых кислот в раствор, которые под действием того же хаотропного агента избирательно сорбируются на поверхности силики. Лизирующий раствор включает в себя 140М GuSCN, 0.1М Tris-HCl, 20% 0.2М EDTA, 16.2М Triton Х-100. Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. С помощью центрифугирования силика с ДНК осаждаются, а супернатант с ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высоко очищенного препарата ДНК, который состоит из 140М GuSCN и 0.1М Tris-HCl с последующей сушкой. Элюция НК осуществляется в ТЕ-буфере и в дальнейшем используют в ПЦР.

К недостаткам данного метода можно отнести высокую стоимость сорбента и ограниченный количественный выход НК в связи с ограничением активной площади сорбирующего вещества. А так же наличие большого количества внеядерного генома и поврежденных НК.

2) Следующий способ [2] заключается в том, что смесь, из предварительно замороженных и растертых 200 мг навески листьев и 700 мкл буфера для экстракции (2% СТАВ, 1.4 М NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris HCl), тщательно перемешивают и инкубируют при 65°C в течение 10 минут. Далее добавляют 220 мкл ацетата калия и помещают пробирку на лед на 20 минут. Центрифугируют пробу в течение 3 минут при скорости 10000 об/мин. Перенести супернатант в чистую пробирку. К супернатанту необходимо добавить равный объем изопропанола, перемешать и центрифугировать 10 минут при 10000 об/мин для осаждения ДНК. Далее полученный осадок ДНК промывается 70% этанолом, растворяется в 200 мкл буфера ТЕ. Для депротеинизации образца внести в пробирку с раствором ДНК равный объем смеси фенол-хлороформа, хорошо перемешать встряхиванием и центрифугировать. Отобрать водную фазу (верхний слой) в чистую пробирку, не захватывая интерфазу. Повторить ту же процедуру со смесью хлороформ - изоамиловый спирт. Отобрать водную фазу с ДНК в чистую пробирку. Высадить ДНК в 2,5 объемами холодного 96% этанола, предварительно прилив к образцу 1/10 объема 3М ацетата K или Na. Проба центрифугируется в течение 10 мин на максимальной скорости. Супернатант слить. Осадок промыть 70% спиртом. Высушить осадок ДНК и растворить в 50 мкл буфера ТЕ.

Недостатками данного способа является проведение депротеинизации образца после осаждения НК, в связи, с чем в выделении НК присутствует большое количество ингибиторов ПЦР, а так же наличие большого количества внеядерного генома и поврежденных НК.

3) Известен способ [3] выделения НК в молекулярной биологии для селективного выделения двунитевой ДНК, однонитевой ДНК или РНК. Лизис производится в растворе (0,2н. NaOH, 1% SDS, 50 мМ Трис-HCl; 10 мМ ЭДТА, 20 мкг/мл РНазы А).Нуклеиновую кислоту сорбируют на аэросиле (А-300) при нужной концентрации хаотропного агента путем добавления к пробе аэросила до конечной концентрации 0,3-0,6%, смесь инкубируют 1-2 мин, аэросил с сорбированной НК осаждают центрифугированием, промывают 80%-ным изопропанолом. ДНК элюируют водой или буфером с низким содержанием солей. В присутствии высоких концентраций хаотропных агентов сорбирует двунитевую ДНК, а при низких - РНК и однонитевую ДНК. Способ позволяет осуществить селективное выделение двунитевой ДНК и однонитевой ДНК или РНК.

К недостаткам данного способа можно отнести высокую стоимость сорбента и ограниченный количественный выход НК в связи с ограничением активной площади сорбирующего вещества. А так же наличие большого количества внеядерного генома и поврежденных НК

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ выделения нуклеиновых кислот с использованием метода [4] выделения ДНК из растительных тканей с использованием лизирующего буфера, последующей очисткой смесью хлороформа и изоамилового спирта и осаждением изопропанолом. 100 мг фрагмента растения лизируют в 400 мкл лизирующего раствора (2% СТАВ, 1.4М NaCI, 20 мМ EDTA, 100 мМ TrisHCI), после добавления 10 мкл РНКазы инкубируют при 65°C в течение 60 мин. После этого проводят двукратную промывку лизата 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (92:8) с промежуточным центрифугированием и переносом супернатанта в чистую пробирку. Осаждение ДНК проводят в присутствии 350 мкл изопропанола, центрифугирование и удаление супернатанта. Осадок ДНК промывают 400 мкл 70% этанола, сушат в течение 60 мин при комнатной температуре. Элюцию проводят в 50 мкл ТЕ-буфера.

Недостатками данного метода является неудовлетворительная активность лизирующего буферного раствора, наличие большого количества внеядерного генома и поврежденных НК. Чистота НК полученных данным методом слабо удовлетворительная.

Проанализировав существующие способы выявлено, что проблема в данной области состоит в том, что отсутствуют способы, позволяющие увеличить выход качественной неповрежденной ядерной ДНК с повышенной чистотой относительно ингибиторов ПЦР

Технический результат изобретения выражается в повышении концентрации цельного ядерного генома и чистоты, относительно ингибиторов ПЦР, и достигается тем, что исследуемый образец гомогенизируют в экстрагирующем буфере, содержащий РVР(поливинилпирролидон), и проводят первичный лизис с использованием TRITON Х-100. Избавляются от супернатанта. Далее проводят лизис с использованием лизирующего раствора состоящего из GuSCN, DTT, EDTA, TRIS-HCl и 15 мкл протеиназы К. Далее проводят хлороформовую экстракцию. Концентрирование НК осуществляют изопропанолом. промывают полученный осадок в 70% этаноле с последующей промывкой ацетоном. Далее высушивают осадок и элюируют в ТЕ-буфере.

Существенными признаками, характеризующими изобретение в отличии от прототипа является использование этапа концентрирования неповрежденных ядер с помощью использования неионного детергента TRITON Х-100 который разрушает клеточные мембраны, но не разрушает ядра клеток и избавления от поврежденных ядер, ДНК и внеядерных частиц (митохондрии, пластиды, рибосомы). Использование фермента протеиназы К и/или РНКазы А, проведение стадии депротеинизации в целях повышения чистоты выделяемых НК.

Предложенный способ поясняется гельэлектрофоретическим разделением растворов НК, выполненных разными лизирующими растворами на разных растительных материалах

На фиг. 1 представлен электрофорез выделения НК растения Xanthium strumarium.

На фиг. 2 представлен электрофорез выделения НК растений рода Cenchrus.

На фиг. 3 - электрофорез продуктов ПЦР с универсальной парой праймеров на пластидную ДНК растений рода Cenchrus.

На фиг. 4 - электрофорез продуктов ПЦР со слабоспецифичной парой праймеров на ядерный геном растений рода Cenchrus.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Выделение ДНК и РНК из растительного материала:

1. Навеску свежего растительного материала 150-200 мг гомогенизируют в фарфоровой ступке пестиком с добавлением 1000-1500 мкл экстрагирующего буфера (ТЕ-буфер) с 1%PVP и переносят 1000 мкл в микропробирку объемом 1,5 мл. Добавляют 250 мкл 25% TRITON Х-100 Тщательно встряхивают на вортексе и термостатируют 1 час при 60°C. Смесь центрифугируют при 5000 об/мин 5 минут с последующим удалением супернатанта не задевая верхний осадочный слой (темного цвета).

2. Ресуспендируют осадок в 1000 мкл ТЕ-буфера с 1% PVP с последующим центрифугированием при 5000 об/мин 5 минут. Супернатант удаляют. Данный этап повторяют 2-3 раза.

3. К осадку добавляют 500-700 мкл лизирующего раствора (4М GuSCN, 0.05М DTT, 5% 0.5М EDTA, 6% 1М TRIS-HCl) и 15 мкл протеиназы К (2 мг/мл). Интенсивно перемешивают на вортексе и термостатируют при 50-60°C в течении часа, периодически перемешивая.

4. Пробирки охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют при 13000 об/мин 5 минут. Переносят максимальный объем супернатанта в новую пробирку не задевая осадок.

5. К супернатанту добавляют равный объем хлороформа и периодически интенсивно встряхивают на вортексе в течении 5-10 минут с последующим центрифугированием при 13000 об/мин 10 минут. Переносят верхний водный слой в новую пробирку не задевая слой хлороформа.

6. К супернатанту добавляют равный объем изопропилового спирта либо 96% этиловый спирт в соотношении 1/2,5, тщательно встряхивают и центрифугируют при 13000 об/мин 5-10 минут. Перед центрифугированием рекомендуется вымораживание образца 20-30 минут при -20°C для повышения выхода НК.

7. Далее избавляются от супернатанта и промывают встряхиванием осадок 70% этанолом в объеме 500 мкл с последующим центрифугированием при 13000 об/мин 5 минут. Удаляют супернатант и промывают встряхиванием осадок ацетоном в объеме 400 мкл с последующим центрифугированием при 13000 об/мин 5 минут. Удаляют супернатант.

8. Осадок сушат в открытых пробирках при 37°C в течении 15-20 минут до полного испарения ацетона.

9. Элюируют НК в 100-150 мкл ТЕ-буфера с нагреванием до 60°C в течении 5 минут.

10. Хранят образцы при -20°C

Пример 2 - выделение ДНК из растительного материала

Выделение ДНК производят идентично примеру 1, за исключением пункта №3. В данном случае, после пункта №2, к осадку добавляют 500-700 мкл лизирующего раствора (4М GuSCN, 0.05М DTT, 5% 0.5М EDTA, 6% 1М TRIS-HCl) и 5-8 мкл РНКазы А (10 мг/мл) Интенсивно перемешивают на вортексе и термостатируют сначала 30 минут при 40°C затем 30 минут при 55°C периодически перемешивая. Затем добавляют 15 мкл протеиназы К (2 мг/мл) и термостатируют 1 час при 60°C периодически перемешивая. Далее все идентично пунктам примера 1.

Для определения качества выделения НК использовались оптические методы. Чистота относительно белка А260/А280 составляет 2,0±0,09 что считается очень чистым выделением НК свободным от ингибиторов ПЦР. Для подтверждения вышеизложенного была проведена ПЦР с универсальной парой праймеров на пластидную ДНК trnH2 / psbAF (DNA barcode) [Sang et al., 1997 and Tate, 2002]. Результат (фиг. 3) подтвердил наличие достаточного количества пластидной ДНК для исследовательских целей

Для подтверждения повышенного содержания ядерного генома была проведена слабоспецифичная реакция ПЦР на ядерный геном парой праймеров FvSTE.s5* (NCBI probe) на которой видно (фиг.4) различие результатов ПЦР амплификации

Данный метод позволяет получить раствор НК высокого качества и высокой концентрации преимущественно ядерного генома, пригодный для лабораторных исследований, в том числе проведения ПЦР. Прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования, и особой подготовки персонала лаборатории (за исключением классической техники безопасности при работе с токсичными легколетучими веществами, такими как хлороформ).

1. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids / R. BOOM [and others] // JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. - 1990. - Vol. 28, No. 3. - p. 495-503

2. Amani Abdel-Latif. Comparison of three genomic DNA extraction methods to obtain high DNA quality from maize / Amani Abdel-Latif, Gamal Osman // Plant Methods (2017)

3. Патент РФ №2119954, кл. C12N 15/10, C07H 21/00, C07H 21/02, C07H 21/04, опубл. 10.10.1998

4. Doyle J.J. and J.L. Doyle. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. // Phytochemical Bulletin, 1987. - T. 19. - P. 11-15