Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Препарат на основе Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 может быть использован при получении пробиотических средств для КРС и птицы, применяемых для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями процессов пищеварения. Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 составляет основу кормовой добавки «Энзимспорин».

Составы питательных сред для культивирования Bacillus subtilis хорошо изучены на лабораторном и промышленном уровнях.

Известна питательная среда для стационарного культивирования Bacillus subtilis - мясопептонный бульон (МПБ). Мясопептонный бульон готовится из мясной воды, к которой добавляют 1% пептона и 0,5% натрия хлористого. Мясную воду получают путем проварки в 2-4-кратном объеме водопроводной воды мяса или фарша крупного рогатого скота или лошадей в течение 1 ч с последующей фильтрацией [1].

Недостатком данной среды является дороговизна используемых компонентов и сложная технология приготовления. Применение данной среды для промышленного производства трудновыполнимо.

Наиболее близким аналогом для культивирования Bacillus subtilis к заявляемой питательной среде является L-бульон. Его готовят следующим образом: состав (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон ферментативный - 15, хлорид натрия - 5, дистиллированная вода - до 1 л (рН 6,8-7,0). Стерилизацию проводили при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут [2].

Недостатком данной среды является то, что при культивировании Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 максимальное количество организмов не выше 5×10⁹ КОЕ/мл.

Цель состоит в разработке состава питательной среды, содержащего доступное и дешевое сырье, обеспечивающее количество Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 в процессе культивирования выше 5×10⁹ КОЕ/мл.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в повышении количества Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 выше 5×10⁹ КОЕ/мл.

Описание изобретения

Для достижения указанного технического результата культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 предложено использовать питательную среду, состоящую из дрожжевого экстракта, пептона ферментативного, хлорид натрия, 96%-го спиртового экстракта кофе арабика, дистиллированной воды, доведенной до объема 1 л (рН 6,8-7,0), при следующем соотношении компонентов (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, 96% спиртовой экстракт кофе арабика 2-40 мл/л, дистиллированная вода - до 1 л. (рН 6,8-7,0). Стерилизация при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут.

Приготовление экстракта включает в себя экстрагирование растительного сырья. В данной работе использовали аппарат Сокслета. На 1 г воздушно-сухого вещества использовали 15 мл растворителя. В качестве растворителей выбрали 96%-ый раствор этанола. В патрон из белой фильтровальной бумаги добавляли 10 г воздушно-сухого растительного сырья, после чего закрывали с обеих сторон и помещали в экстрактор Сокслета. В колбу добавляли 150 мл растворителя и начинали экстрагирование на водяной бане. Продолжительность экстрагирования - 3 часа, количество циклов - 10. На выходе получали спиртовой экстракт растительного сырья.

Опыт поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Для приготовления жидкой питательной среды в колбу Эрленмейера (объем 50 мл) добавляли компоненты среды, при соотношении г/л: дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, определенные объемы экстрактов кофе арабика (см. таблица1), дистиллированная вода - до 1 л. (рН 6,8-7,0). Закрывали ватно-марлевой пробкой и стерилизовали при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут. Затем, в остывшую жидкую питательную среду (объем 50 мл) в стерильных условиях вносили навеску 0,5 г лиофилизированно высушенных спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079.

Культивирование производили в шейкер-инкубаторе "Innova 44" (New Brunswick, США) при вращении со скоростью 250 оборотов в минуту (эксцентриситет 5 см), температуре 37°С в течение 24 часов.

Для определения количества использовали стандартный метод десятикратных разведений с пересевом на питательный агар, приготовленный при следующем соотношении компонентов (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, агар-агар - 18, дистиллированная вода - до 1 л. (рН 6,8-7,0). Стерилизацию проводили при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут. Затем термостатировали при температуре 37°С в течение 24 часов. В качестве контрольной пробы использовали среду, без внесения экстрактов кофе арабика. Эксперименты проведены семь раз.

Из приведенных данных видно (табл. 1), что максимальное увеличение количества бактерий достигается при добавлении 20 мл 96%-го спиртового экстракта кофе арабика в L-бульон.

Таким образом, предлагаемая питательная среда для культивирования бактерии Bacillus subtilis ВКПМ -12079 содержит доступное сырье, а ее использование позволяет повысить количество микроорганизмов до 2×10¹³ КОЕ/мл.

Литература

1. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований. / Под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. - М.: Медицина, 2005. - С. 480

2. Бойко С.С, Яценко Е.С. Влияние ультразвука на Bacillus subtilis в процессе стационарного культивирования // Технологии и оборудование химической, биотехнологический и пищевой промышленности. Материалы X Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием. - Бийск, 2017. - С. 321-324.