Результат интеллектуальной деятельности: Производное класса N-гликозидов индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-дионов - N-{ 12-(β-D-ксилопиранозил)-5,7-диоксо-индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с] карбазол-6-ил} пиридин-2-карбоксамид, обладающее цитотоксической и противоопухолевой активностью

Изобретение относится к областям фармацевтической химии и медицины и касается производного N-гликозида индолокарбазола, обладающего цитотоксической и противоопухолевой активностью. Изучаемые соединения этого класса представляют собой производные малеимида индоло[2,3-а]карбазола, в котором один из индольных атомов азота связан гликозидной связью с остатками различных моносахаров и содержат различные заместители по имидному атому азота общей формулы (1).

где Gly - остатки пентоз и гексоз,

R - представляет аминогруппу, бензамидогруппу, (пирид-2-ил)аминогруппу, ацетамидогруппу или карбамидогруппу.

Прототипом заявляемого соединения является 6-амино-12-(α-L-арабинопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-дион [патент РФ №2548045]. Недостатками прототипа являются недостаточно высокий и длительны" противоопухолевый эффект, а также отсутствие увеличения продолжительности жизни животных с солидными опухолями.

Задачей изобретения является получение более эффективного соединения этого ряда.

Задача решается тем, что предложено новое соединение N-{12-(β-D-ксилопиранозил)-5,7-диоксо-индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-6-ил}пиридин-2-карбоксамид, обладающее более высокой противоопухолевой активностью.

Техническим результатом является более высокий и длительный эффект торможения роста опухоли, а также увеличение продолжительности жизни опытных животных.

Заявляемое соединение N-{12-(β-D-ксилопиранозил)-5,7-диоксо-индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-6-ил}пиридин-2-карбоксамид было изучено: in vitro на клетках линии рака толстой кишки человека НСТ-116, наиболее чувствительных к соединениям этого класса, и проявило заметную цитотоксическую активность (IC₅₀ 1,7⋅10^-6М).

Клетки выращивали на среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка, в термостате при 5% содержании СО₂ и при t=37°С. Цитотоксическую активность оценивали по выживаемости клеток. Выживаемость клеток определяли с помощью стандартного МТТ-теста с использованием МТТ-реагента (3,4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолиум бромид), основанного на способности дегидрогеназ живых метаболически активных клеток восстанавливать МТТ-реагент до голубых нерастворимых кристаллов формазана [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, М., с. 649-651].

Исследования выполнены с использованием 96-луночных микропланшет. Клетки линии НСТ-116 рассевали в 180 мкл питательной среды и выращивали в течение 24 час. Затем добавляли соединение в диапазоне концентраций от 0,01 мкМ до 100 мкМ в объеме 20 мкл. Время инкубации заявляемого соединения с клетками линии НСТ-116 составляло 48 час. Контролем служили образцы клеток НСТ-116, к которым заявляемое соединение не добавляли. Через 48 час. в лунки с клетками добавляли МТТ-реагент в конечной концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировали в течение 2 час. Выпавшие кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 20 мин. при t=37°С. Далее оптическое поглощение окрашенных растворов измеряли на счетчике оптического поглощения при длине волны 540 нМ. При этом оптическое поглощение растворенного в ДМСО формазана соответствовало количеству живых клеток в пробе. Выживаемость клеток для каждой концентрации изучаемого соединения определяли по формуле (в %).

(По/Пк)×100,

где По - оптическое поглощение растворенного в ДМСО формазана в опытных образцах,

Пк - оптическое поглощение растворенного в ДМСО формазана в контрольных образцах.

На основании полученной кривой «доза-эффект» вычисляли значение ингибирующей концентрации (IC₅₀, мкМ) соединения, при которой поглощение в опытных образцах составляет 50% от контрольных образцов.

Ошибка измерений не превышала 5%.

Соединение также было изучено in vivo на пяти солидных и двух асцитных моделях опухолей животных.

Исследования выполняли на перевиваемых моделях опухолевого роста мышей: асцитной форме лимфоцитарного лейкоза Р388, асцитной форме опухоли Эрлиха и солидных опухолях: аденокарциноме толстой кишки (штамм АКАТОЛ), эпидермоидной карциноме легких Льюис (LLC) и раке шейки матки РШМ 5 и меланоме В 16.

Мышей получали из разведения экспериментально-биологической лаборатории (виварий) ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Использованы мыши (самки) гибриды первого поколения BDF1 (DBA₂×C57Bl/6j), мыши самки линии BALB/C и мыши самки линии DBA2 в возрасте 1,5-2 месяца с начальной массой 19-23 г.

Животные содержались в виварии РОНЦ им. Н.Н. Блохина в соответствии с санитарными правилами по содержанию лабораторных животных: на брикетированном корме и постоянном доступе к воде, в помещении с естественным освещением и контролируемыми температурой 18°-22°С и влажностью воздуха 65%. Клетки из полипропилена, подстил - опилки.

Перед лечением мышей распределяли по группам. Число животных в контрольной группе составляло 10 мышей, в опытных группах по 7 животных. Наблюдение за животными проводили до их гибели.

Работы с животными проводили в строгом соответствии с законодательством Российской Федерации, положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», требованиями и рекомендациями «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных».

Штаммы перевиваемых опухолей получали из группы крио- консервации биоматериалов лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России и поддерживали in vivo в отделе экспериментальной химиотерапии на линейных животных.

В опытах использовали 2-10 пассажи in vivo. Опухоли перевивали лабораторным животным по стандартным методикам. Инокуляция опухолевых клеток проводили подкожно в правую подмышечную область каждой мыши по 50 мг взвеси опухолевых клеток в питательной среде 199 в разведении 1:10 (5×10⁶ клеток) для солидных опухолей. Асцитные опухоли прививали внутрибрюшинно по 10⁶ клеток на мышь в 04 мл питательной среды 199.

Асцитные опухоли: лимфоцитарный лейкоз Р388 перевиваемая опухоль мышей с коротким жизненным циклом, поддерживается на мышах линии ДВА2, средняя продолжительность жизни привитых мышей 9-12 дней; опухоль Эрлиха - отличается более продолжительным жизненным циклом животных, поддерживается на беспородных мышах, средняя продолжительность жизни привитых мышей 12-20 дней.

Солидные опухоли: аденокарцинома молочной железы Са 755, поддерживается на линейных мышах линии С57Вl/6j. Средняя продолжительность жизни животных с опухолью 26 дней;

Аденокарцинома толстой кишки АКАТОЛ, поддерживается на мышах линии BALB/C, средняя продолжительность жизни животных с опухолью - 57 дней.

Эпидермоидная карцинома легких Льюис (LLC) с быстрым ростом, постоянным метастазированием в легкие и избирательной чувствительностью к определенным группам противоопухолевых препаратов; поддерживается на линейных мышах линии BALB/C. Средняя продолжительность жизни животных с опухолью 24 дня.

Рак шейки матки РШМ - 5 представляет собой плоскоклеточный ороговевающий рак, отличается высокой дифференцированностью и медленным ростом, может способствовать выявлению веществ, активных при лечении солидных опухолей, отличающихся теми же признаками, поддерживается на линейных мышах линии СВА. Средняя продолжительность жизни животных с опухолью 43 дня.

Меланома В-16 отличается медленным ростом и сохранением некоторых признаков, характерных для меланом человека. Проявляет весьма умеренную чувствительность к известным препаратам, поддерживается на линейных мышах линии C57Bl/6j. Средняя продолжительность жизни животных с опухолью 30-40 дней.

Лечение мышей с асцитными опухолями начинали через 24 часа, а мышей с солидными опухолями через 48 часов после перевивки опухолей.

Мышам с асцитными и солидными опухолями препарат вводили внутрибрюшинно, ежедневно в течение пяти дней.

В опытах использованы 2-10 пассажи in vivo. Опухоли перевивали лабораторным животным по стандартным методикам.

Критерием оценки противоопухолевой активности на асцитных моделях являлось увеличение продолжительности жизни животных. На солидных моделях опухолей оценку результатов лечения проводили по показателям торможения роста опухолей и увеличению продолжительности жизни.

Торможение роста опухоли (ТРО) вычисляли по формуле:

ТРО%=(Vk-Vo)/Vk×100,

где Vk и Vo - средний объем опухолей (мм³) в контрольной и опытной группах, который для каждой солидной опухоли определяли как произведение размеров трех перпендикулярных диаметров опухолевого узла.

Проводили измерение объема опухолей на разные сроки после окончания лечения, с интервалом 4 дня.

Увеличение продолжительности жизни (УПЖ) леченных животных по сравнению с контролем вычисляли по формуле:

УПЖ%=(СПЖо-СПЖк)/СПЖк×100,

где СПЖо и СПЖк - средняя продолжительность жизни (сутки) в опытных и контрольных группах животных. Показатели эффективности изучаемого препарата определяли в сравнении с контрольными группами.

Активными в противоопухолевом отношении считали дозы препаратов, вызывающие торможение роста опухоли ≥50% продолжительностью не менее 7 дней после окончания лечения или увеличения продолжительности жизни животных ≥25%.

Токсичность изученных режимов и доз препаратов оценивали по срокам гибели леченных животных в сравнении с гибелью животных в контрольной группе, состоянию внутренних органов животных (селезенки, легких, наличию метастазов в легких). Состояние животных визуально оценивали ежедневно. Трупы животных утилизировали в соответствии с санитарными правилами ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Для выполнения экспериментов составляли группы численностью, достаточной для проведения статистического анализа и расчета показателей достоверности. Различия между контрольными и экспериментальными группами считали достоверными при 95% уровне значимости (р<=0.05) Статистическая обработка данных выполняли с помощью программы Statistica for Windows 5.5.

Изобретение иллюстрируется таблицами 1-3.

В таблице 1 представлена противоопухолевая активность N-{12-(β-D-ксилопиранозил)-5,7-диоксо-индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-6-ил}пиридин-2-карбоксамида на модели лимфолейкоза Р-388.

В таблице 2 представлена противоопухолевая активность N-{12-(β-D-ксилопиранозил)-5,7-диоксо-индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-6-ил}пиридин-2-карбоксамида на солидных моделях.

В таблице 3 представлена противоопухолевая активность прототипа - 6-амино-12-(α-L-арабинопиранозил)индоло-[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона.

Изучаемое соединение вводили в смеси вспомогательных компонентов (ДМБО, Kollidon 17 PF, вода) [патент РФ №2572691] ежедневно внутрибрюшинно в течение пяти дней.

Результаты изучения противоопухолевой активности заявляемого соединения на лимфолейкозе Р 388 в диапазоне доз от 20-100 мг/кг представлены в таблице 1. Увеличение продолжительности жизни опытных животных по сравнению с контролем коррелирует с величиной использованной дозы. Наилучший результат был получен при дозе 100 мг/кг. УПЖ при этом составило 93,3%, но сопровождалось образованием опухолевых узлов в брюшной полости животных.

Терапевтической дозой для асцитных моделей была выбрана доза 60 мг/кг. На асцитной опухоли Эрлиха при этой дозе увеличение продолжительности жизни животных составило 393%. При этом 4 мыши из 7 были полностью излечены.

Эта же доза оказалась оптимальной для моделей солидных опухолей LLC, В 16, Са 755. На аденокарциноме толстого кишечника мышей АКАТОЛ более высокие результаты были получены при дозе 80 мг/кг.

Помимо торможения роста опухоли, отмечено увеличение продолжительности жизни животных (таблица 2).

Значимый противоопухолевый эффект (ТРО выше 50%) на В-16 и Са-755 сохранялся до 20 дня, а на LLC и АКАТОЛЕ до 25 дня.

В таблице 3 для сравнения представлены данные, полученные при изучении прототипа заявляемого соединения 6-амино-12-(α-L-арабинопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона на тех же экспериментальных моделях [патент РФ 2548045]. Максимальная активность в этом случае наблюдалась непосредственно после окончания введения препарата и быстро снижалось: на меланоме В-16 и РШМ-5 после седьмого дня, на LLC и АКАТОЛЕ - после 16 дня.

Таким образом, заявляемое соединение обладает выраженной цитотоксической активностью на культуре клеток рака толстой кишки человека НСТ-116 и длительным противоопухолевым эффектом на моделях солидных опухолях мышей: меланоме В-16, эпидермоидной карциноме легкого Льюиса, аденокарциноме толстой кишки АКАТОЛ, аденокарциноме молочной железы Са-755 и асцитных формах: лимфоцитарного лейкоза Р-388 и опухоли Эрлиха.

Для получения заявляемого N-{12-(β-D-ксилопиранозил)-5,7-диоксо-ндоло[2,3-а]-пирроло[3,4-с]карбазол-6-ил}пиридин-2-карбоксамида в качестве исходного был использован 12-(2,3,4-три-O-ацетил-β-D-ксилопиранозил)индоло[2,3-а]фурано[3,4-с]-карбазол-5,7-дион, который при действии гидразида пиколиновой кислоты с последующим удалением защитных групп углеводного остатка. Полученное заявляемое соединение было охарактеризовано данными спектров: ¹Н-ЯМР и масс- высокого разрешения. Спектр ¹Н-ЯМР записан на приборе Bruker DRX-500 с программным обеспечением, внутренний стандарт - тетраметилсилан, химические сдвиги 6 приведены в миллионных долях (м.д.). При описании формы сигналов приведены следующие сокращения: с- синглет, д - дублет, т - триплет, м - мультиплет, дд - дублет дублетов, уш. с. - уширенный синглет; уш.д. - уширенный дублет; значение констант спин-спинового взаимодействия J приведены в герцах. Масс-спектры высокого разрешения были зарегистрированы на приборе Bruker micrOTOF II методом электрораспылительной ионизации (ESI). Измерения выполнены на положительных (напряжение на капилляре - 4500 V) или отрицательных (напряжение на капилляре 3200 V) ионах. Диапазон сканирования масс- m/z 50-3000 Д, калибровка - внешняя или внутренняя (Electrospray Calibrant Solution, Fluka). Использовался шприцевой ввод вещества для растворов в ацетонитриле, скорость потока - 3,4 мкл/мин. Газ-распылитель - азот (4 л/мин.), температура интерфейса - 180°С. Приведены значения m/z (отношение массы частиц к заряду). За ходом реакции следили с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). ТСХ проводили на силуфоле в системах: бензол:ацетон: 1:1 и 1:2.

Получение соединения N-{12-(β-D-ксилопиранозил)-5,7-диоксо-индоло[2,3-а]-пирроло[3,4-с]карбазол-6-ил}пиридин-2-карбоксамида

Смесь, состоящую из 105 мг (0,18 мМ) 12-(2,3,4-три-O-ацетил-β D-ксилопиранозил)-индоло[2,3-а]фурано-[3,4-с]карбазол-5,7-диона и 110 мг (0,8 мМ) α-пиколиногидразида в 1,5 мл диметилформамида перемешивали в течение 1,5 минут. Растворитель упарили, к остатку добавили 10 мл воды. Выпавший осадок отфильтровали, промыли водой (10 мл), высушили, получили 70 мг ацетилированного N-{12-(β-D-ксило-пиранозил)-5,7-диоксо-индоло[2,3-а]-пирроло[3,4-с]карбазол-6-ил}пиридин-2-карбокса-мида. Выход 91%.

¹Н-ЯМР (CDCl₃): 10,10 (с, 1Н, NH индол), 8,79 (д, 1Н, Ar), 8,68 (д, 1Н, Ar), 8,13 (т, 2Н, Ar), 7,70 (т, 2Н, Ar), 7,42-7,22 (м, 6Н, Ar) 6,04 (д, 1Н, H1', J_1'2' 9.0), 5.40 (т, 1Н, Н2'), 5.01 (м, 2Н, Н3') 4.77 (дд, 1Н, Н5', J_5'4' 5.2), 4.01 (т, 1H, Н5', J_5'5'' 11.6), 2.14, 1.88, 0.86 (3с, 9Н, 3Ас). Масс-спектр: C₃₇H₂₉N₅O₁₀, М+Н 714,39; M+Na 736,38.

К 70 мг (0,1 мМ) ацетилированного N-{12-(β-D-ксилопиранозил)-5,7-диоксо-индоло[2,3-а]-пирроло[3,4-с]карбазол-6-ил}пиридин-2-карбоксамида в 2 мл абсолютного метанола добавили 0,3 мл 0,1 N раствора метилата натрия в метаноле. Реакционную массу перемешивали в течение 30 минут. Выпавший осадок отфильтровали, промыли водой, высушили. Выход N-{12-(β-D-ксилопиранозил)-5,7-диоксо-индоло[2,3-а]-пирроло[3,4-с]карбазол-6-ил}пиридин-2-карбоксамида. Выход 64,4%.

¹Н-ЯМР (DMSO-d6): 11,44 (с, 1Н, NH индол), 9,18 (д 1Н. Ar), 9,16 (д, 1Н, Ar), 8,84 (с, 1Н, NH), 8,15-7,39 (м, 10Н, Ar), 6,24 (уш. д. 1Н, Н1'), 4,70-3,75 (м, 5-Н, Н2', Н3', Н4', Н5', Н5'').

Масс-спектр: C₃₁H₂₃N₅O₇, М+Н 578,33; M+Na 600,32.