Результат интеллектуальной деятельности: Способ оценки степени образования везикул эритроцитов

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследований, и может использоваться для оценки степени образования везикул эритроцитов.

Известно, что везикуляция эритроцитарных мембран происходит при апоптозе, хранении крови и многих заболеваниях человека (Зубаиров Д.М., Зубаирова Л.Д. Микровезикулы в крови, функции и их роль в тромбообразовании. М.:ГЭОТАР-МЕДИЯ, 2009, 167 с).

Однако до настоящего времени не существует методов, с помощью которых можно было бы определить степень образования везикул эритроцитов in vitro.

Наиболее известным и простым является метод получение везикул после истощения эритроцитов по АТФ. Однако везикулы, полученные после истощения эритроцитов по АТФ, не имеют на своей поверхности отрицательно заряженного фосфолипида - фосфатидилсерина (Willekens F.L.A. Erythrocyte vesiculation a survival strategy. Laboratory of Medical Immunology // Radbout Universiteit, Nijmegen. 2010.189). Поэтому они не обладают прокоагулянтной активностью. Этим они отличаются от везикул, образующихся при патологии различного генеза.

Известно, что прогревание суспензии эритроцитов при 49°С приводит к образованию везикул (Wagner G.M. et al. Red cell vesiculation - a common membrane physiologic event. J. Lab. Clin. Med. 1986. V. 108. P. 315-324). При этом показано, что образующие везикулы обладают прокоагулянтной активностью.

Известно, что количество образующихся везикул определяют путем измерения активности ацетилхолинэстеразы (Greenwalt T.J. The how and why of exocytic vesicles. Transfusion.-2006. V.46. 143-152) или определения их общего белка (Vader P. et al. Taxol- induced phosphatidylserine exposure and microvesicle formation in red blood cells is mediated by its vehicle cremophor. Nanomedicine. 2013. V. 8. P. 1127-1133).

Задача - создание нового, несложного, не требующего специального оборудования способа оценки степени образования везикул эритроцитов, является актуальной.

Задача достигается способом, который заключается в том, что эритроциты выделяют из крови, помещают на водяную баню и прогревают при 49°С в течение 8 мин. После этого суспензию эритроцитов центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. К супернатанту добавляют хлористый гадолиний до финальной концентрации 400-600 мкМ, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке, содержащем везикулы, определяют количество общего белка. По содержанию общего белка везикул судят о степени образования везикул эритроцитов.

Способ осуществляется следующим образом. Кровь забирают в вакуумные пробирки, содержащие 3.8% цитрата натрия (9:1). Пробирки центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Плазму и клетки белой крови убирают, после чего эритроциты трижды промывают физиологическим раствором. 0.05 мл промытых эритроцитов добавляют к 10 мл забуференного физиологического раствора (10 мМ трис - HCl, 150 мМ NaCl, рН 7.4), суспензию клеток помещают на водяную баню и прогревают при 49°С в течение 8 мин. После этого суспензию эритроцитов центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. К супернатанту добавляют хлористый гадолиний до финальной концентрации 400-600 мкМ, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяют содержание общего белка. По содержанию общего белка везикул судят о степени образования везикул эритроцитов.

Пример 1. Отмытые эритроциты здорового донора помещали на водяную баню и прогревали при 49°С в течение 8 мин. После этого суспензию эритроцитов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до финальной концентрации 400-600 мкМ, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли содержание общего белка. Содержание белка везикул составило 20 мкг/мл.

Пример 2. Отмытые эритроциты больного болезнью Крона помещали на водяную баню и прогревали при 49°С в течение 8 мин. После этого суспензию эритроцитов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до финальной концентрации 400-600 мкМ, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли содержание общего белка. Содержание белка везикул составило 53 мкг/мл.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа можно выяснить степень образования везикул. Так, наибольшая степень образования везикул эритроцитов наблюдается у больного болезнью Крона.

Преимуществом предлагаемого способа является быстрота, простота, доступность, отсутствие необходимости в сложном дорогостоящем оборудовании.