Результат интеллектуальной деятельности: СБОР, ОБЛАДАЮЩИЙ ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к сборам лекарственных трав, применяемых для профилактики и лечения сахарного диабета 2 типа.

В настоящее время на проявление возможной гипогликемической активности исследуют сотни растений по всему миру. Применяют различные комбинации лекарственных трав, способствующих снижению уровня сахара в крови, повышению секреции инсулина, обладающих мочегонными и общеукрепляющими свойствами. Наиболее часто используются такие растения, как: черника обыкновенная (побеги), одуванчик лекарственный (корни), фасоль обыкновенная (створки плодов), галега лекарственная (трава), аралия маньчжурская (корень), лимонник китайский (плоды), орех грецкий (листья), брусника обыкновенная (листья), толокнянка обыкновенная (листья).

В Государственный реестр лекарственных средств России по состоянию на 2017 год входит три средства растительного происхождения, обладающие гипогликемическим действием: «Арфазетин», в составе которого содержатся побеги черники обыкновенной, створки плодов фасоли обыкновенной, корневища и корни элеутерококка/ аралии маньчжурской/ корневища с корнями заманихи, плоды шиповника, трава хвоща полевого, трава зверобоя, цветки ромашки; имеющий такой же состав сбор-порошок «Арфазетин-ЭК»; а также сбор «Арфазетин-Э», содержащий элеутерококка корни, зверобоя траву, ромашки цветки, фасоли обыкновенной плодов створки, хвоща полевого траву, черники побеги, шиповника плоды [Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://grls.rosminzdrav.ru/default.aspx. Дата доступа: 10.08.2017]. Данные сборы включают в себя такие виды сырья, как корневища и корни элеутерококка колючего, корни аралии маньчжурской, что ограничивает прием данных сборов у людей с гипертонией, продолжительное время и во второй половине дня.

Прототипом изобретения стала известная композиция, обладающая гипогликемическим действием, включающая в себя траву галеги обыкновенной, листья ореха грецкого, траву горца птичьего, соцветия коровяка скипетровидного, корни одуванчика лекарственного, цветки липы сердцевидной, листья шелковицы белой, корни девясила высокого, листья брусники, створки плодов фасоли обыкновенной, листья барвинка малого, траву репешка обыкновенного в различных соотношениях [патент RU 2430735, 2011]. Из-за токсического действия барвинка прием данной композиции должен осуществляться под строгим наблюдением за состоянием здоровья в течение недлительного периода, также не рекомендуется использовать средство при гипотонии из-за риска критичного снижения артериального давления. Алкалоиды галеги (галегин, пеганин), угнетают моторную функцию кишечника, нарушение работы которого могут стать противопоказанием к применению данного сбора.

Задачей изобретения является повышение эффективности лечения и расширение ассортимента на российском фармацевтическом рынке лекарственных средств растительного происхождения, применяемых для профилактики и лечения сахарного диабета 2 типа.

Технический результат при использовании изобретения - достижение стойкого гипогликемичекого эффекта за счет мощного антиоксидантного действия и возможности длительного применения.

Предлагаемый сбор, обладающий гипогликемической активностью, содержит корни одуванчика лекарственного, траву тысячелистника, листья крапивы, листья подорожника, листья земляники, листья брусники, створки плодов фасоли обыкновенной при их равном соотношении. Средство может быть выполнено в форме фиточая в фильтр-пакетах. Все входящие в состав сбора лекарственные растения произрастают на территории Российской Федерации и разрешены к применению в официнальной медицине.

Входящие в состав предлагаемого сбора растения содержат различные группы биологически активных веществ, обеспечивающих проявление фармакологических эффектов.

Листья брусники содержат арбутин, гидрохинон и вакцинин, оказывают мочегонное и антимикробное действие. Благодаря мочегонному действию, способствует ускорению выведения глюкозы из организма, снижая гипергликемию. В эксперименте доказано гипогликемическое действие экстракта брусники на крысах с аллоксановым диабетом [Барнаулов, О.Д. Сравнительная оценка влияния фитопрепаратов из растений флоры России на концентрацию инсулина и глюкозы в крови крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом. / О.Д. Барнаулов // Психофармакология и биологическая наркология. - 2008. - том 8. выпуск 3-4. - С. 2484-2489].

Листья земляники содержат флавоноиды - производные кверцетина, дубильные вещества, аскорбиновую кислоту и органические кислоты, большое количество калия, полисахариды и каротин. Растение оказывает мягкое мочегонное и желчегонное, а также спазмолитическое действие [Калинкина, Г.И. Лекарственные растения, сырье и фитопрепараты. Учебное пособие. Часть I. / Г.И. Калинкина, Н.В. Тихонов, Е.Н. Сальникова - Томск: Изд. СибГМУ, 2004. - 116 с.]. Благодаря большому количеству флавоноидов, оказывает антиоксидантное действие [da Silva Pinto М. et al. Evaluation of antiproliferative, anti-type 2 diabetes, and antihypertension potentials of ellagitannins from strawberries (Fragaria × ananassa Duch.) using in vitro models // Journal of medicinal food. - 2010. - T. 13. - №.5. - C. 1027-1035].

В состав корней одуванчика входят тритерпеновые и стероидные соединения (тараксерол, тараксол, тараксастерол, b-ситостерин и стигмастерин). За счет содержания горьких веществ растение стимулирует перистальтику, усиливает секрецию пищеварительных желез и оказывает спазмолитическое действие. Корни одуванчика лекарственного содержат инулин, который применяется в медицинской практике как заменитель сахара и крахмала при сахарном диабете. При гидролизе инулина образуется фруктоза, введение которой в организм приводит к нормализации синтеза гликогена. Также, в ходе экспериментальных исследований установлено, что препараты корней одуванчика лекарственного оказывают желчегонное, мочегонное и гипохолестеринемическое действие [Фруентов Н.К. Лекарственные растения Дальнего Востока. - Рипол Классик, 1987. - 347 с.]. В эксперименте было установлено, что отвар из корней одуванчика лекарственного снижает уровень сахара в крови [Нуридуллаева К.Н., Выпова Н.Л., Урманова Ф.Ф. К изучению гипогликемических свойств корней одуванчика лекарственного // Современные тенденции развития науки и технологий - 2016. - Т. 1 - №5 - С. 131]

Створки фасоли используют для лечения сахарного диабета 2 типа легкой и средней степени тяжести. Биологически активные вещества створок фасоли многообразны и включают флавоноиды (рутин, кемпферол-3-глюкуронозид, кверцетин-3-глюкуронозид, изокверцитрин), оксикумарины, фенолокислоты и фазеолозиды (тритерпеновые гликозиды) [Калинкина, Г.И. Лекарственные растения, сырье и фитопрепараты. Учебное пособие. Часть II. / Г.И. Калинкина, Н.В. Тихонов, Е.Н. Сальникова - Томск: Изд. СибГМУ, 2004. - 148 с]. Есть данные о том, что фасоль обыкновенная содержит вещество, ингибирующее альфа-амилазу и снижающее уровень глюкозы в крови [Barrett M.L., Udani J.K. A proprietary alpha-amylase inhibitor from white bean (Phaseolus vulgaris): a review of clinical studies on weight loss and glycemic control // Nutrition journal. - 2011. - T. 10. - №.1. - С. 1].

Листья крапивы двудомной содержат хлорофилл, витамин К, аскорбиновую кислоту и каротиноиды, органические кислоты, уртицин и другие биологически активные вещества. Растение оказывает кровоостанавливающее, желчегонное, гипохолестеринемическое действие, стимулирует регенерацию тканей и уменьшает метеоризм [Калинкина, Г.И. Лекарственные растения, сырье и фитопрепараты. Учебное пособие. Часть I. / Г.И. Калинкина, Н.В. Тихонов, Е.Н. Сальникова - Томск: Изд. СибГМУ, 2004. - 116 с.]. Включение в состав сбора листьев крапивы двудомной обеспечивает антиоксидантное действие, замедляя развитие осложнений и облегчая течение заболевания.

Трава тысячелистника содержит терпены (производные азулена), флавоноиды, горечь ахиддеин, витамин К, полисахариды, флавоноиды, органические спирты и кислоты, в том числе хлорогеновую кислоту. Растение оказывает кровоостанавливающее, противовоспалительное, бактерицидное и желчегонное действие [Муравьева, Д.А Фармакогнозия / Д.А. Муравьева., И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. - М.: Медицина, 2002. - 656 с.]. Я не знаю, как им объяснить, зачем он здесь нужен) Результаты современных исследований показали также наличие у него таких специфических фармакологических активностей как антиоксидантная и иммуномодулирующая [J. Freysdottir et al. 2016. A polysaccharide fractioa. from Achillea millefolium increases cytokine secretion and reduces activation of Akt, ERK and NF-rmkappaB in THP-1 monocytes. Carbohydrate Polymers http://dx.doi.Org/10.1016/i.carbpol.2016.02.017; Cristiane Hatsuko Baggio et al. 2015. Modulation of antioxidant systems by subchronic exposure to the aqueous extract of leaves from Achillea millefolium L. in rats. Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters, DOI: 10.1080/14786419.2015.1030738].

Листья подорожника содержат полисахариды в больших количествах, дубильные и горькие вещества, аукубин, витамины К и U, аскорбиновую кислоту и органические кислоты. Растение оказывает регулирующее действие на секрецию желудка и обладает противовоспалительной активностью [Муравьева, Д.А Фармакогнозия / Д.А. Муравьева., И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. - М.: Медицина, 2002. - 656 с.]. Полисахариды подорожника большого и других видов рода способны снижать уровень глюкозы в крови [Hannan J.М.A. et al. Aqueous extracts of husks of Plantago ovata reduce hyperglycaemia in type 1 and type 2 diabetes by inhibition of intestinal glucose absorption // British Journal of Nutrition. - 2006. - T. 96. - №.01. - C. 131-137].

Предлагаемое сочетание лекарственных трав в сборе обеспечивает гипогликемичекое действие. Предлагаемый сбор повышает эффективность лечения за счет мощного антиоксидантного действия, а также возможности длительного применения, расширяет арсенал лекарственных средств растительного происхождения.

Технология приготовления сбора соответствует требованиям Государственной фармакопеи XIII издания и заключается в том, что лекарственные растения смешивают при равном соотношении компонентов, сбор измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито диаметром 2 мм. Затем для получения настоя заливают водой комнатной температуры в соотношении 1:10, настаивают на водяной бане в течение 15 минут. Затем охлаждают при комнатной температуре не менее 45 минут, процеживают (отжимая растительное сырье) и прибавляют воду до требуемого объема извлечения [Государственная фармакопея Российской Федерации. - 13-е изд. - М., 2015. - Т. 2 - 1004 с.].

Гипогликемическая активность предлагаемой растительной композиции была изучена в эксперименте на крысах с стрептозоцин-индуцированным сахарным диабетом. Диабет у крыс вызывали путем однократного введения диабетогенной дозы стрептозоцина (производства «Stigma - Aldrich Fine Chemicals») из расчета 80 мг на 100 г массы тела.

В эксперименте были использованы крысята линии Вистар (67 особей весом от 100 до 120 г.), содержавшиеся при естественном освещении, на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92) в условиях вивария с соблюдением положений «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях», утвержденной в 2007 г.

Животных разделили на четыре группы:

№1 - опытная группа, в которой животных поили настоем из предлагаемого сбора;

№2 - группа сравнения, в которой животных поили настоем из известного сбора «Арфазетин», включенного в государственный реестр лекарственных средств;

№3 - контрольная группа, в которой животных поили только водой;

№4 - интактная группа, животные данной группы не подвергались индуцированию сахарным диабетом.

Настои из исследуемого растительного сбора вводили крысятам перорально в течение 14 дней по 1 мл. Объем извлечения рассчитывали, исходя из рекомендуемой суточной дозы для взрослого человека массой 70 кг - стакан настоя три раза в день:

210 мл*3=360 мл в сутки,

360 мл/70 кг=9 мл/кг.

Следовательно, для крысенка массой 100 г доза составляет 1 мл.

За течением экспериментального диабета следили по повышению уровня глюкозы и альфа-амилазы в крови, а так же физическому состоянию животных (снижению массы тела, увеличению потребления воды и диуреза). Уровень глюкозы в крови определяли ферментативным методом с использованием стандартного набора реагентов «Глюкоза-ФКД», а уровень альфа-амилазы с помощью набора «альфа-Амилаза Ольвекс» оптимизированным энзиматическим кинетическим методом на 7 и 14-й день.

Через сутки после введения стрептозоцина наблюдалось увеличение уровня глюкозы и альфа-амилазы в крови. Через двое суток общее состояние животных ухудшилось: они стали чаще пить воду, терять вес, наблюдалось снижение двигательной активности, учащение мочеиспускания. Животные опытной группы, по сравнению с контрольной и группой сравнения выглядели лучше, были более подвижны, незначительно теряли в весе (табл. 1). Начиная с 3 суток отмечался падеж животных. Смертность от диабета в контрольной группе и в группе сравнения составила 100%, в опытной группе - 41,7%. К 7 суткам в контрольной и группе сравнения пали все животные. Уровень альфа-амилазы в крови опытной группы на 14 сутки приблизился к таковым значениям интактной группы.

Острую токсичность настоя из сбора гипогликемического изучали на 18 белых беспородных мышах обоего пола массой 18-22 г. Подготовку животных к исследованию проводили по общепринятой схеме (голодание, маркировка, взвешивание, разделение по группам). Условия содержания животных соответствовали общепринятым стандартам по экспериментальному изучению безопасности веществ. Настой из сбора, приготовленный согласно требованиям Государственной фармакопеи XIII издания [Государственная фармакопея Российской Федерации. - 13-е изд. - М., 2015. - Т. 2 - 1004 с.], перорально вводили в дозах 5000, 7500 и 10000 мг/кг массы животных, в пересчете на сухой вес сбора. Каждую дозу исследовали на 6 мышах. За животными вели наблюдения в течение 14 дней, отмечали клиническую картину отравления (внешний вид, поведенческая реакция, активность, частота дыхания, пробы на рефлекторную возбудимость, изменение массы тела), устанавливали взаимосвязь между количеством выживших животных и дозой.

При введении исследуемых доз настоя из сбора гипогликемического не было отмечено признаков отравления, все животные во время эксперимента были подвижны, имели хороший аппетит. Летальных исходов в опытной группе не наблюдалось. Максимальная доза введения настоя составила 10000 мг/кг. Дальнейшие токсикологические исследования не проводились из-за явной не токсичности изучаемых видов сырья (табл. 2). Таким образом, согласно классификации ГОСТ 12.1.007-76, сбор гипогликемический был отнесен к классу малотоксичных соединений [ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности].

Антиоксидантную активность сбора определяли с использованием различных методов. Исследуемым раствором являлись водные извлечения из сбора гипогликемического, приготовленные по методике Государственной Фармакопеи XIII издания [Государственная фармакопея Российской Федерации. - 13-е изд. - М., 2015. - Т. 2 - 1004 с.].

Первый метод заключается в способности адреналина к аутоокислению в щелочной среде, с образованием продукта, имеющего максимум поглощения при 347 нм. К 2 мл бикарбонатного буфера (рН=10,56) добавляли 0,1 мл 0,1% раствора адреналина гидрохлорида (раствор контроля) и через 10 минут определяли оптическую плотность при длине волны 347 нм в кювете толщиной 10 мм на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (D1). К 2 мл бикарбонатного буфера добавляли 0,03 мл исследуемого раствора и 0,1 мл 0,1% раствора адреналина гидрохлорида, через 10 минут определяли оптическую плотность (D2).

Антиоксидантную активность рассчитывали по формуле:

AOA=(D1-D2)*100/D1

Величина АОА более 10% свидетельствует о наличии антиоксидантной активности. При определении АОА также учитывалось, что исследуемый раствор имеет собственную окраску, которая поглощает определенную длину волны в видимой области спектра.

Вторым методом антиоксидантную активность сбора гипогликемического определяли in vitro методом хемилюминесценции [Влияние водных извлечений из некоторых лекарственных растений на процессы свободно-радикального окисления / Рыжикова М.А. [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1999. - Т. 62., №2. - С. 36-38.]. В качестве раствора сравнения использовали водное извлечение плодов шиповника, известного растительного антиоксиданта. Водные извлечения (0,05 и 0,1 г/мл) вносили в различные модельные системы, в которых генерировалось образование АФК и протекали реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ), как наиболее распространенные процессы свободно-радикального окисления.

В качестве первой модельной системы использовали 20 мл фосфатного буфера с добавлением цитрата натрия и люминола (рН=7,5). Добавляли 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа, как инициатора процесса окисления. Окисление солей железа обуславливает появление кислородных радикалов и сопровождается хемилюминесценцией, усиливающейся в присутствии люминола. Регистрацию свечения проводили в течение 5 минут.

В качестве второй модели использовали липопротеиновые комплексы, сходные с липидами крови, приготовленные из куриного желтка. Желток смешивали с фосфатным буфером в соотношении 1:5 и гомогенизировали. В качестве инициатора процесса окисления ненасыщенных жирных кислот добавляли 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа.

Контролем служили модельные системы без добавления исследуемых извлечений. Регистрацию свечения проводили на приборе «ХЛМ-003». Антиоксидантную активность оценивали по снижению интенсивности свечения.

Величина антиоксидантной активности при определении ее первым методом составила 76,92%. При проведении исследований методом хемилюминесценции, также наблюдались высокие результаты (табл. 3).

Таким образом, предлагаемый сбор оказывает гипогликемическое и антиоксидантное действие и позволяет расширить арсенал лекарственных средств растительного происхождения на Российском фармацевтическом рынке.