Результат интеллектуальной деятельности: Фосфониевые соли на основе бетулиновой кислоты, обладающие цитотоксической активностью в отношении аденокарциномы предстательной железы

Изобретение относится к области органической химии, в частности, к новым фосфониевым солям на основе лупанового тритерпеноида - бетулиновой кислоты формулы 1-5:

которые могут найти применение в фармакологии и медицине.

Природные пентациклические тритерпеноиды лупанового ряда характеризуются широким спектром биологической активности, в частности, противоопухолевой (Planta Med. 2009, 75, 1549-1560), относительной легкостью получения из растительного сырья и огромной сырьевой базой. Некоторые из них, например, соединение NVX-207 проходит клинические испытания в качестве противоопухолевого препарата (Eur. J. Clin. Invest. 2009, 39, 5, 384-394).

К настоящему времени "классическая" химиотерапия, мишенью для которой является жизненно важные белки и нуклеиновые кислоты клетки, достигла своей эффективности. Опухолевые клетки быстро приобретают резистентность к известным противоопухолевым препаратам, а применение новых цитостатиков со сходным механизмом действия редко приводит к значительным успехам. Изменение структуры цитостатиков, увеличение доз, использование ингибиторов лекарственной резистентности не позволяют добиться увеличения терапевтического индекса, т.е. летального повреждения опухолевых клеток без развития острой токсичности для организма в целом. В настоящее время все большую популярность получает новое направление противоопухолевой терапии - таргетная терапия. Среди большого числа таргетных соединений, которые действуют на определенные мишени опухолевой клетки, выделяют митохондриально-направленные противоопухолевые соединения.

В ряде исследований показано, что тритерпеноиды лупанового ряда вызывают гибель опухолевых клеток посредством активации апоптоза по митохондриальному пути (Cancer Res. 1997, 57, 4956-4964; BioMed Res. Int. 2015, 2015, 584189). Изучение механизма гибели показало, что под действием тритерпеноидов наблюдается выход проапоптотических белков из межмембранного митохондриального пространства в цитоплазму. Бетулиновая кислота стимулирует открытие митохондриальных транзитных пор (МТП). Открытие МТП приводит к утечке протонов, нарушению функционирования дыхания и как следствие - выходу в цитоплазму митохондриальных апоптотических белков (Apoptosis 2009, 14, 191-202)

Известно, что катион трифенилфосфония (ТРР) селективно накапливается в раковых клетках (Biomed. Pharmacother. 1985, 39, 220-226).

Соединения, содержащие трифенилфосфониевую группу (ТРР), предложены в качестве митохондриальных агентов, влияющих на ингибирование пролиферации опухолевых клеток (Anti-Cancer Drug Des. 1989, 4, 265-280.) Серия митохондриально-направленных соединений на основе бетулина и бетулиновой кислоты, содержащих ТРР группу, была синтезирована и определена их цитотоксичность на опухолевых линиях различного генеза.

Так, цитотоксическая активность трифенилфосфониевых солей бетулиновой кислоты Al (IC₅₀=1.20 μM), А2 (IC₅₀=1.15 μМ) и А5 (IC₅₀ 1.10 μМ) в отношении клеток мастоцитомы Р-815 превысила активность бетулиновой кислоты (IC₅₀ 41.00 μM) в ~35-40 раз. В отношении клеток опухоли Эрлиха соединения Al, А2 и А5 проявили цитотоксичность в интервале IC₅₀ 2.30÷1.37 μМ, в то время как бетулиновая кислота была малоактивна (IC₅₀ 54.00 μМ) (патент РФ №2551647, опубл. 12.11.2012).

Цитотоксичная активность солей А8 (IC₅₀ 0.98 μМ), А10 (IC₅₀ 0.74 μМ) и A11 (IC₅₀ 0.95 μМ) в отношении опухолевых клеток нейробластомы (TET21N), АН (IC₅₀ 0.70 μМ) в отношении опухолевых клеток карциномы молочной железы (MCF-7) превысила активность бетулиновой кислоты для MCF-7 и эфира бетулиновой кислоты с дихлоруксусной кислотой в отношении к TET21N (Med. Chem. Commun., 2017, 8, 1934-1945).

Высокая цитотоксичность была установлена для соединения А12 в отношении опухолевых клеток миелоидной лейкемии K562 (IC₅₀ 0.57 μМ), промиелоцитарного лейкоза HL-60 (IC₅₀ 0.6 μМ), плоскоклеточного рака пищевода ЕСА-109 (IC₅₀ 0.78 μМ), карциномы легкого А 549 (IC₅₀ 0.61 μМ) (J. Med. Chem. 2017, 60, 6353-6363). Для соединения А13 установлена высокая цитотоксичность в отношении опухолевых клеток промиелоцитарного лейкоза HL-60 (IC₅₀ 0.32 μМ) (J. Med. Chem. 2017, 60, 6353-6363).

Найдено, что соединение А14 обладает высокой активностью в отношении винбластин резистентных клеток MCF-7/Vinb (IC₅₀ составляет 0.045 μМ) (J. Nat. Prod., 2017, 80, 8, 2232-2239).

Наиболее структурно близким аналогом заявляемым соединениям является производное бетулиновой кислоты А15 (Med. Chem. Commun., 2017, 8, 1934-1945), где ТРР группа присоединена ковалентно к С-28 углеродному атому лупанового остова через алкильный спейсер С₄. Цитотоксичность соединения А15 определена в отношении опухолевых клеток нейробластомы (TET21N) и опухолевых клеток карциномы молочной железы (MCF-7).

Авторами в уровне техники не выявлены фосфониевые соли на основе бетулиновой кислоты, проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевой клеточной линии РС-3 (аденокарцинома предстательной железы человека).

По данным ВОЗ, смертность от злокачественных новообразований в развитых странах занимает третье место в структуре общей смертности, уступая лишь ишемической болезни сердца и цереброваскулярным нарушениям. Среди онкологических заболеваний существенную часть представляют гормон зависимые опухоли репродуктивной системы.

Рак предстательной железы (РПЖ) считается сегодня одной из самых серьезных медицинских проблем среди мужского населения. В Европе РПЖ является наиболее распространенной солидной неоплазмой (опухолью), заболеваемость которой составляет 214 случаев на 1000 мужчин, опережая рак легких и колоректальный рак. К тому же в настоящее время РПЖ занимает 2-е место среди основных причин смерти от рака у мужчин. Широкое распространение и применение в клинической онкологии получили антрациклиновые антибиотики, в частности, доксорубицин. Однако применение доксорубицина, как и других химиотерапевтических средств, сопряжено с развитием побочных эффектов, в некоторых случаях требующих снижения дозы или полной отмены препарата. Кроме того, со временем развивается резистентность опухолевых клеток к цитостатическому действию доксорубицина.

Задачей изобретения является разработка новых соединений на основе природного лупанового тритерпеноида - бетулиновой кислоты, обладающие высокой противоопухолевой активностью в отношении аденокарциомы простаты и расширяющие арсенал известных лекарственных средств указанного назначения.

Технический результат - новые фосфониевые соли на основе бетулиновой кислоты, обладающие цитотоксической активностью в отношении аденокарциномы предстательной железы на уровне доксорубицина.

Технический результат достигается заявляемыми фосфониевыми солями на основе бетулиновой кислоты формулы (1-5), получаемыми нагреваниием С-28 галогеналкильных эфиров бетулиновой кислоты (6-10) с трифенилфосфином в ацетонитриле в атмосфере аргона по схеме 1

Исходные С-28 галогеналкильные эфиры бетулиновой кислоты (6-10) синтезированы по известной методике: (J. Asian Nat. Prod. Res. 2014, V. 16, 34-42).

Изобретение иллюстрируется примерами получения заявляемых соединений (1-5) и исследования их противоопухолевой активности.

Пример 1. О-(3-Трифенилфосфониопропил)-3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оат бромид (1) Смесь 1.5 г (2.5 ммоль) соединения 6, 15 мл ацетонитрила и 1.4 г (5.2 ммоль) трифенилфосфина нагревают при кипении в атмосфере аргона 4-5 ч (контроль методом ТСХ). Затем растворитель удаляют отгонкой в вакууме (12 Торр), осадок растворяют в 3 мл CHCl₃, осаждают петролейным эфиром и отфильтровывают. Выход 1.8 г (90%). Белый порошок, Т пл.=155°С, [α]_D²⁰=-1.0 (С 1.0 CHCl₃). ИКС, ν, см^-1: 3378 (С³-ОН), 3060, 2943, 2869, 1722 (С=O), 1641 (С=С), 1588, 1439, 1377, 1295, 1154, 1040, 997. ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц)δ, м.д.: 0.73, 0.76, 0.79, 0.93, 0.97 (15Н, с, Н-(23-27)), 1.66 (3Н, с, Н-30), 2.9 (1Н, м, Н-19), 3.16 (1Н, д.д, J=11.1, 4.7 Гц, Н-3), 3.7 (2Н, м, CH₂P), 4.46 (2Н, м, С(O)O-CH₂), 4.6 (1Н, с, H_A-29), 4.7 (1Н, с, H_B-29), 7.6-7.8 (15Н, м, Н-С_ар); ¹³С ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ_С, м.д.: 14.7, 15.4, 16.0, 16.1, 18.2, 19.2, 19.3, 20.8, 22.5, 22.6, 25.4, 27.3, 28.0, 29.0, 29.6, 30.5, 32.0, 36.9, 37.1, 38.1, 38.8, 40.6, 42.3, 46.8, 49.3, 50.4, 55.2, 56.5, 62.8, 63.4, 72.2., 78.7, 109.7, 117.5 (СН, д, J=88.8 Гц, С^ипсо), 130.28 (СН, д, J=13.2 Гц, С^мета), 133.98 (СН, д, J=11.0 Гц, С^орто), 135.15 (СН, д, J=2.9 Гц, С^пара), 150.2, 175.6; ³¹Р ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ_Р, м.д.: 25.4; Масс спектр (MALDI-TOF), m/z: 681.6 [М-Br]⁺(вычислено 761.6: [М]⁺)

Пример 2. О-(5-Трифенилфосфониопентил)-3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оат бромид (2) получают аналогично примеру 1 из 1.1 г (1.8 ммоль) соединения 7, 15 мл ацетонитрила и 0.95 г (3.6 ммоль) трифенилфосфина. Выход 1.8 г (95%). Белый порошок, Т пл.=150°С, [α]_D²⁰=+0.5 (С 1.0 СНС1₃). ИКС, ν, см^-1: 3393 (С³-ОН), 2941, 2868, 1718 (С=O), 1641 (С=С), 1588, 1439, 1376, 1242, 1176, 1046, 983. ¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц)δ, м.д.: 0.74, 0.77, 0.83, 0.93, 0.95 (15Н, с, Н-(23-27)), 1.65 (3Н, с, Н-30), 2.9 (1H, м, Н-19), 3.16 (1Н, д.д, J - 11.1, 4.7 Гц, Н-3), 3.9 (2Н, м, CH₂P), 4.0 (2Н, м, С(O)O-CH₂), 4.57 (1Н, с, H_A-29), 4.7 (1Н, с, H_B-29), 7.7-7.9 (15Н, м, Н-С_ар); ¹³С ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ_С, м.д.: 14.6, 15.3, 16.0, 16.1, 18.2, 19.3, 20.9, 22.2, 22.5, 22.8, 25.5, 26.6, 26.7, 27.4, 28.0, 28.2, 29.6, 29.5, 29.6, 30.6, 32.0, 34.3, 37.0, 37.1, 38.2, 38.7, 39.3, 40.7, 42.3, 47.0, 49.3, 50.5, 55.3, 56.4, 63.2, 78.8, 109.5, 118.4 (СН, д, J=88.8 Гц, С^ипсо), 130.28 (СН, д, J=13.2 Гц, С^мета), 133.98 (СН, д, J=11.0 Гц, С^орто), 135.15 (СН, д, J=2.9 Гц, С^пара), 150.5, 176.0;³¹Р ЯМР(CDCl₃, 400 МГц) δ_Р, м.д.: 24.3 Масс спектр (MALDI-TOF), m/z: 710.6 [М-Br]⁺(вычислено 790.6:[М]⁺)

Пример 3. О-(6-Трифенилфосфониогексил)-3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оат бромид (3) получают аналогично примеру 1 из 0.57 г (0.9 ммоль) соединения 8, 15 мл ацетонитрила и 0.49 г (1.8 ммоль) трифенилфосфина. Выход 0.7 г (85%). Белый порошок, Т пл.=158-162°С, [α]_D²⁰=+2.3 (С 0.87 СНС1₃). ИКС, ν, см^-1: 3369 (С³-ОН), 2941, 2866, 1718 (С=O), 1640 (С=С), 1588, 1438, 1376, 1318, 1176, 1047, 983. ¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц)δ, м.д.: 0.74, 0.77, 0.85, 0.93, 0.95 (15Н, с, Н-(23-27)), 1.66 (3H, с, Н-30), 2.95 (1H, м, Н-19), 3.17 (1Н, д.д, J=11.1, 4.7 Гц, Н-3), 3.9 (2Н, м, CH₂P), 4.0 (2Н, м, С(O)O-CH₂), 4.57 (1H, с, Н_А-29), 4.68 (1Н, с, H_B-29), 7.7-7.9 (15Н, м, Н-С_ар); ¹³С ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ_С, м.д.: 14.6, 15.3, 16.0, 16.1, 18.2, 19.3, 20.9, 22.5, 22.6, 22.6, 23.0, 25.2, 25.5, 25.7, 25.7, 27.4, 28.0, 28.3, 29.6, 29.9, 30.0, 30.6, 32.1, 34.3, 37.0, 37.1, 38.2, 38.7, 38.8, 40.7, 42.3, 47.0, 49.3, 50.3, 55.3, 56.5, 63.7, 78.9, 109.5, 118.4 (СН, д, J=88.8 Гц, С^ипсо), 130.4 (СН, д, J=13.2 Гц, С^мета), 133.7 (СН, д, J=11.0 Гц, С^орто), 135.0 (СН, д, J=2.9 Гц, С^пара), 150.6, 176.1; ³¹Р ЯМР (CDC1₃, 400 МГц) δ_Р, м.д.: 24.9 Масс спектр (MALDI-TOF), m/z: 801.59 [М-Br]⁺ (вычислено 881.6: [М]⁺)

Пример 4. О-(9-Трифенилфосфониононил)-3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оат бромид (4) получают аналогично примеру 1 из 0.5 г (0.75 ммоль) соединения 9, 15 мл ацетонитрила и 0.4 г (1.5 ммоль) трифенилфосфина. Выход 0.6 г (95%). Т пл.=105°С, [α]_D²⁰=+1.3 (С 1.0 СНС1₃). ИКС, ν, см^-1: 3371 (С₃-ОН), 2936, 2864, 1719 (С=O), 1641 (С=С), 1588, 1484, 1376, 1271, 1176, 1046, 983. ¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц)δ, м.д.: 0.74, 0.80, 0.89, 0.95 (15Н, с, Н-(23-27)), 1.67 (3H, с, Н-30), 2.9 (1Н, м, Н-19), 3.16 (1H, д.д, J=11.1, 4.7 Гц, Н-3), 3.7 (2Н, м, CH₂P), 4.0 (2Н, т, J=6.4 Гц С(O)O-CH₂), 4.57 (1H, с, H_A-29), 4.7 (1Н, с, H_B-29), 7.7-7.9 (15Н, м, Н-С_ар); ¹³С ЯМР(СОС1₃, 400 МГц) δ_С, м.д.: 14.7, 15.3, 16.0, 16.1, 18.2, 19.3, 20.9, 22.6, 22.7, 22.75, 25.5, 26.0, 27.3, 28.0, 28.6, 29.0, 29.1, 29.6, 30.3, 30.4, 30.6, 30.8, 32.2, 34.3, 37.0, 37.2, 38.3, 38.7, 40.7, 42.4, 47.0, 49.4, 50.5, 55.3, 56.5, 63.9, 78.9, 109.5, 118.4 (СН, д, J=88.8 Гц, С^ипсо), 130.28 (СН, д, J=13.2 Гц, С^мета), 133.98 (СН, д, J=11.0 Гц, С^орто), 135.15 (СН, д, J=2.9 Гц, С^пара), 150.6, 176.2; ³¹Р ЯМР(CDC1₃, 400 МГц) δ_Р, м.д.: 24.3 Масс спектр (MALDI-TOF), m/z: 843.9 [M-Br]⁺ (вычислено 923.9:[М]⁺)

Пример 5. О-(10-Трифенилфосфониодецил)-3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оат бромид (5) получают аналогично примеру 1 из 1.35 г (1.9 ммоль) соединения 10, 15 мл ацетонитрила и 1 г (3.9 ммоль). Выход 1.5 г (89%). Белый порошок, Т пл.=110°С, [α]_D²⁰=+2.7 (С 1.0 CHCl₃). ИКС, ν, см^-1: 3393 (С³-ОН), 2933, 2863, 1720 (С=O), 1641 (С=С), 1588, 1484, 1376, 1269, 1176, 1047, 984. ¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц)δ, м.д.: 0.69, 0.75, 0.85, 0.91 (15Н, с, Н-(23-27)), 1.63 (3H, с, Н-30), 2.9 (1Н, м, Н-19), 3.12 (1Н, д.д, J=11.1, 4.7 Гц, Н-3), 3.6 (2Н, м, CH₂P), 4.0 (2Н, т, J=6.4 Гц С(O)O-CH₂), 4.53 (1H, с, H_A-29), 4.66 (1Н, с, H_B-29), 7.7-7.9 (15Н, м, Н-С_ар); ¹³С ЯМР(CDCl₃, 400 МГц) δ_С, м.д.: 14.6, 15.4, 15.9, 16.0, 18.2, 19.3, 20.8, 22.6, 22.65, 22.75, 25.5, 26.0, 27.3, 28.0, 28.6, 29.1, 29.3, 29.6, 30.3, 30.5, 30.6, 32.1, 34.3, 37.0, 37.1, 38.2, 38.7, 38.8, 40.7, 42.3, 47.0, 49.3, 50.5, 55.3, 56.5, 63.8, 78.8, 109.5, 118.3 (СН, д, J=88.8 Гц, С^ипсо), 130.28 (СН, д, J=13.2 Гц, С^мета), 133.98 (СН, д, J=11.0 Гц, С^орто), 135.15 (СН, д, J=2.9 Гц, С^пара), 150.6, 176.2; ³¹Р ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ_Р, м.д.: 24.8; Масс спектр (MALDI-TOF), w/z: 777.6 [M-Br]⁺ (вычислено 857.6: [М]⁺)

Пример 6. Биологическая активность

Использовались линия опухолевых клеток РС-3 (аденокарцинома предстательной железы человека), нормальные первичные фибробласты кожи человека (HSF). Клетки культивировали асептически на поверхности культуральных фласков в стандартных условиях: в базовой питательной среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 mM L-глутамина, 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в увлажненной воздушной атмосфере с 5% CO₂.

Для исследования цитотоксичности клетки высаживали на поверхности 96-луночного планшета в питательной среде. Добавляли к клеткам растворы соединений до конечной концентрации от 2 нМ до 12,5 мкМ и культивировали 3 суток в стандартных условиях. Цитотоксичность соединений оценивали с помощью МТТ-теста согласно стандартному протоколу (The molecular probes handbook. A guide to fluorescent probes and labeling technologies. Editors I. Johnson, M. T. Z. Spence, 11^th Edition, 2010, Life technologies, 1060 p)

Жизнеспособность клеток оценивалась как процент от контрольных клеток, выращенных без соединений (жизнеспособность контрольных клеток 100%). Полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC50) рассчитывались по кривым жизнеспособности клеток с использованием программного обеспечения OriginPro 8.0.

На основании полученных результатов по цитотоксичности фосфониевых солей бетулиновой кислоты 1-5 можно сделать следующие выводы:

Заявляемые соединения обладают более высокой цитотоксичностью по сравнению с доксорубицином при длине линкера n=3, 5 (соединения 1, 2). Индекс селективности (IS), т.е. отношение значений IC₅₀ для клеток HSF и клеток РС-3, наилучший у соединений 1 и 2, и составляет 17.1 и 11.8 соответственно. Для доксорубицина индекс селективности составляет 8.5.

Таким образом, соединения 1, 2 - фосфониевые соли бетулиновой кислоты обладают высокой цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток РС-3 с высокой селективностью в сравнении с нормальными клетками, что свидетельствует о возможности их использования в качестве противоопухолевых препаратов.

Заявлены новые фосфониевые соли на основе бетулиновой кислоты, обладающие высокой цитотоксичностью в отношении аденокарциомы предстательной железы и расширяющие арсенал известных лекарственных средств указанного назначения. Выявлены соединения, превышающие уровень активности доксорубицина и в сравнении с этим препаратом с более высоким индексом селективности по отношению к нормальным клеткам.