Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения средства, обладающего желчегонной, противовоспалительной и антиоксидантной активностью

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа производства лекарственных препаратов из растительного сырья.

В последнее время заболевания органов пищеварения имеют широкое распространение в результате несбалансированного питания, стрессов, аутоиммунных заболеваний, злоупотребления алкоголем и курения [7].

Среди лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, около 40% приходится на препараты растительного происхождения. Интерес к лекарственным растениям постоянно растет, так как по сравнению с синтетическими средствами лекарственные средства растительного происхождения действуют на организм человека более мягко и дают меньше побочных эффектов. Больным с хроническими заболеваниями растительные средства можно применять длительное время. Преимуществом лекарственных растений и препаратов из них является то, что они содержат комплекс биологически активных веществ, которые обуславливают широту их фармакологического действия на организм человека [10].

В качестве желчегонных средства используется водный настой цветков бессмертника песчаного в соотношении (1:20) [3]. Также применяют настои из цветков пижмы, столбиков с рыльцами кукурузы [10].

Нестойкость при хранении водных извлечений в виде настоев и отваров является их недостатком, срок годности ограничивается двумя сутками при температуре +4°С [2]. Использование воды очищенной в качестве экстрагента не позволяет извлекать в полной мере флавоноиды [8]. В растениях, обладающих желчегонным действием, чаще всего основными биологически активными веществами являются флавоноиды. Например, бессмертник песчаный содержит флавоноиды салипурпозид, нарингенин, апигенин, гликозиды кемпферола, пижма обыкновенная содержит флавоноиды производные лютеолина, апигенина, акацетина, кверцетина, изорамнетина [4].

Экстракты сухие представляют собой порошкообразные массы, обладающие свойством сыпучести, с содержанием влаги не более 5%. Сухие экстракты получают высушиванием густых экстрактов или непосредственно из очищенной вытяжки с использованием методов, обеспечивающих максимальное сохранение действующих веществ: распыление, лиофилизация, сублимация и др. В качестве экстрагента применяют воду очищенную, спирт этиловой различной концентрации.

Известен способ получения средства, обладающего желчегонной активностью «Способ получения средства, обладающего желчегонным действием» [патент РФ 2465000, кл. А61К 36/534, А61К 36/23, А61К 36/28, B01D 11/02, А61Р 1/16, опубл. 27.10.2012, авторы Абрамова Я.И., Чучалин B.C., Шейкин В.В.]. Способ получения средства заключающийся в том, что измельченные цветки бессмертника песчаного, траву тысячелистника обыкновенного и листья мяты перечной смешивают с плодами кориандра, экстрагируют 40% спиртом этиловым путем многоступенчатой противоточной экстракции, отстаивают, фильтруют, сгущают при определенных условиях. Средство, полученное вышеописанным способом представляет собой экстракт густой (с остаточной влажностью 25%).

Известны способы получения средств, обладающих желчегонной и противовоспалительной активностью. «Способ получения средства, обладающего желчегонной и противовоспалительной активностью» [патент РФ 2159123, кл. А61Р 1/16, опубл. 20.11.2000, авторы Чехирова Г.В., Самбуева З.Г., Ербаева Л.В., Асеева Т.А., Николаев С.М., Петров Е.В., Дашинамжилов Ж.Б.]. Способ представляет собой получение экстракта сухого из сырья корневищ и корней девясила высокого, софоры желтоватой, кровохлебки лекарственной, корневищ имбиря лекарственного, древесины бузины сибирской, плодов боярышника кроваво-красного, яблони ягодной путем экстракции 25-30% этиловым спиртом.

«Способ получения средства, обладающего желчегонной, противовоспалительной активностями» [патент 2557990, опубл. 27.07.2015, авторы: Лубсандоржиева П.Б., Федоров А.В., Самбуева З.Г., Николаев С.М.]. Способ представляет собой получение средства, обладающего желчегонной активностью, путем экстракции измельченной надземной части ломатогониума каринтийского 96% этанолом двукратно при комнатной температуре, затем 40% этанолом, добавляя экстрагент в количестве, равном слитому, двукратно. Извлечения объединяют, концентрируют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу для получения экстракта сухого, при определенных условиях.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения средства, обладающего желчегонной и противовоспалительной активностью [патент РФ 2160598, М. кл. А61К 35/78, А61Р 1/16, А61Р 29/00 опубл. 10.11.2002 г. авторов Будаева С.Б. Асеева Т.А. Николаева И.Г. и др.]. Способ заключается в экстракции травы зубчатки обыкновенной 35-45% спиртом этиловым в соотношении сырье:экстрагент =1: 12-14 с учетом коэффициента водопоглощения в течение 60 мин при температуре 60-65°С при постоянном помешивании. Процесс повторяют дважды. Аналогичным способом проводят третью экстракцию в течение 30 мин. Объединенные водно-спиртовые извлечения фильтруют, упаривают до 1/3 первоначального объема. Кубовый остаток сепарируют. Полученный продукт доупаривают приблизительно до 1/5 первоначального объема и высушивают в вакуум-сушильном шкафу.

К недостаткам способа относится то, что для экстракции используется спирт невысокой концентрации 40-45%), который не позволяет достичь максимального извлечения из сырья флавоноидов, производных лютеолина и агликонов флавоноидов. Кроме того, продолжительность первого контакта фаз 60 мин не дает достаточную эффективность экстракции для первой ступени.

Техническим результатом предлагаемого способа является увеличение выхода целевого продукта, содержания в нем биологически активных веществ и расширение спектра фармакологического действия.

Технический результат обеспечивается путем экстракции растительного сырья спиртом этиловым 60% и 70%, очистки, упаривания и сушки.

Новым в достижении технического результата является то, что в качестве растительного сырья используют траву володушки козелецелистной.

Володушка козелецелистная (Bupleurum scorzonerifolium Willd.), семейства Зонтичных (Apiaceae) - многолетнее травянистое растение 20-60 см высотой, стебли прямостоячие, одиночные или несколько. Прикорневые листья и нижние стеблевые линейно-ланцетовидные длиной 3-15 см, шириной 2-6 мм, суженые к обоим концам. Цветки мелкие, с желтым венчиком, собраны в соцветия зонтики, образующие рыхлое метельчатое соцветие. Плоды - стручки размером 2-2,5 мм продолговато-яйцевидные, с тупыми короткими ребрами [13]. Володушка козелецелистная распространена на Алтае, Туве, Центральной Сибири, на Дальнем Востоке. Встречается в луговых степях, суходольных лугах, в разнотравных лесах, по вырубкам и опушкам, по южным каменистым склонам. В траве володушки козелецелистной содержатся флавоноиды (кверцетин, лютеолин-7-глюкозид, гиперозид, рутин, виценин, апигенин, изорамнетин-3-глюкозид, изокверцетин), фенолкарбоновые кислоты (кофейная, хлорогеновая, галловая, цикориевая, феруловая, розмариновая), кумарин, катехин, эпикатехин [6]. Их максимальное количество накапливается в траве в период цветения. В народной медицине володушка козелецелелистная в виде настоев применяется при заболеваниях печени, желчного пузыря [14].

Целью настоящего изобретения является повышение выхода целевого продукта и содержания в нем биологически активных веществ, расширение спектра фармакологического действия, которые обеспечиваются трехкратной экстракцией травы володушки козелецелистной спиртом этиловым 60% и 70%, при соотношении сырье-экстрагент 1:14 в динамических условиях -перемешивание сырья, температурой экстракции 60°С, и тем, что после объединения извлечений проводят отстаивание.

Оптимальные параметры экстракции были установлены экспериментально (табл. 1-5).

Новым является то, что в качестве экстрагента используется спирт этиловый 60% и 70%. Экспериментальные данные показали, что использование концентрации спирта менее 60% и более 70% ведет к снижению выхода экстрактивных веществ, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот (табл. 1). Содержание экстрактивных веществ определяли по методике ГФ XIII [2], суммы флавоноидов - спектрофотометрическим методом, основанном на реакции комплексообразования с алюминия хлоридом. В качестве стандартного образца использовали рутин, т.к. максимум поглощения спиртового извлечения травы володушки козелецелистной совпадает с максимумом поглощения стандартного образца рутина при 412 нм. Количество суммы фенолкарбоновых кислот определяли методом прямой спектрофотометрии, расчет процентного содержания проводили по удельному показателю поглощения кофейной кислоты равном 782 при длине волны 325 нм.

Новым является также и то, что для экстракции используют сырье с размером частиц 2 мм, т.к. использование сырья с большим размером частиц приводит к снижению выхода экстрактивных веществ, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот (табл. 2).

Новым является - продолжительность ступеней экстракции: 1-ая ступень - 120 мин, 2-ая ступень - 60 мин, 3-я ступень - 30 мин (табл. 5), обеспечивающая увеличение выхода целевого продукта.

Новым также является использование на ступенях экстракции спирта разной концентрации (1 и 2 ступень - 60% спирт этиловый, 3 ступень - 70% спирт этиловый). Применение 60% спирта этилового на 1 и 2 ступенях экстракции обеспечивает извлечение из сырья флавоноидов в виде гликозидов. На 3 ступени применение спирта 70% дает возможность извлечь дополнительно гликозиды и свободные агликоны, которые на 1 и 2 ступени 60%) спиртом этиловым не извлекаются.

Новым является то, что перед стадией упарки и сепарирования проводится дополнительная очистка объединенного извлечения отстаиванием при температуре +5°С в течение 72 часов, а далее извлечение фильтруют через друк-фильтр.

Для расчета эффективности экстракции определяли выход экстрактивных веществ (флавоноидов) на каждой ступени экстракции, суммировали и рассчитывали выход по отношению к массе сухого сырья (табл. 6).

Расчет процентного выхода экстрактивных веществ (флавоноидов) к массе сырья (Y,%) проводили по формуле:

, где

X - рассчитанная масса сухого остатка (флавоноидов) в общем объеме по трем ступеням, г, равная 1,43720;

m - масса абсолютно сухого сырья (4,50 г).

Эффективность экстракции (S,%) по экстрактивным веществам (флавоноидам) рассчитывали по формуле:

, где

Y - выход экстрактивных веществ к абсолютно сухому сырью, %; Е - содержание экстрактивных веществ в сырье, %, равное 39,70%;

Эффективность экстракции сырья по экстрактивным веществам составляет 80,45%, по флавоноидам - 93,34%.

Также были проведены исследования по количественному содержанию суммы флавоноидов, суммы фенолкарбоновых кислот в целевых продуктах, полученных по известному способу и предлагаемому. Так, содержание по известному способу суммы флавоноидов составляет 15,52%, по предлагаемому - 19,39%; суммы фенолкарбоновых кислот по известному способу - 10,34%), по предлагаемому - 12,03% (табл. 12).

Выход целевого продукта по известному способу - 20,95%), по предлагаемому - 22,42%.

Применение для экстракции спирта этилового 60 и 70%, степени измельченности сырья 2 мм, увеличение продолжительности первой ступени экстракции до 120 минут, введение стадии отстаивания объединенного извлечения дает увеличение выхода целевого продукта и повышение содержания в нем флавоноидов и фенолкарбоновых кислот.

Новым является то, что комплекс биологически активных веществ экстракта сухого, полученного по предлагаемому способу обладает не только желчегонной и противовоспалительной активностью, а также проявляет антиоксидантное действие (табл. 7-11).

Сопоставительный анализ заявляемого решения и прототипа показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что в качестве сырья используют траву володушки козелецелистной с размером частиц сырья - 2 мм; продолжительность экстракции 1 ступени - 120 минут; экстракцию на 3-ей ступени проводят 70% спиртом этиловым; проводят отстаивание объединенного извлечения при температуре +5°С; далее осуществляют очистку фильтрованием через друк-фильтр, доупарка извлечения проводится до объема, что соответствует критерию «новизна».

Новая совокупность существенных признаков обеспечивает увеличение целевого продукта и содержания в нем суммы флавоноидов на 24,94%), суммы фенолкарбоновых кислот на 16,34%), расширение сырьевой базы за счет широко произрастающей володушки козелецелистной, что соответствует критерию «промышленная применимость».

При анализе известных способов было выявлено, что в них отсутствуют сведения о влиянии отличительных признаков заявляемого способа на достижение технического результата, следовательно, изобретение соответствует «изобретательскому уровню».

Оптимальные условия экстракции были положены в основу технологического процесса.

Пример. Описание технологического процесса получения экстракта сухого володушки козелецелистной (ЭСВК).

100 г травы володушки козелецелистной (влажность 10%) с размером частиц сырья 2 мм, помещают в экстрактор и заливают 1400 мл 60%) спирта этилового. Экстракцию проводят на магнитной мешалке при температуре 60°С. Первый контакт фазы - 120 мин. Извлечение сливают в количестве 980 мл (плотность - 0,754 г/см³) и заливают сырье свежим экстрагентом - 60% спиртом этиловым в объеме равном слитому. Продолжают экстракцию в течение 60 минут. Экстрагент сливают в количестве 960 мл, сырье заливают 70% спиртом этиловым в объеме равном слитому и продолжают экстракцию в течение 30 минут. Экстрагент сливают в объеме 880 мл. Полученные извлечения объединяют и помещают в холодильник при температуре +5°С на 72 часа. Затем извлечение фильтруют через друк-фильтр. Далее фильтрат подают на упарку в ротационный испаритель. Упарку ведут при температуре реакционной массы 60°С и давлении 9,81 гПа до первоначального объема, остаток передают на операцию сепарирования. Получают очищенное извлечение в количестве 700 мл (плотность 1,030 г/см³) подают в вакуум-распылительную сушилку до остаточной влажности экстракта сухого не более 5%.

Получают экстракт сухой в количестве 22,42 г, что составляет 22,42% от массы воздушно-сухого сырья.

Экстракт сухой представляет собой аморфный порошок коричневого цвета со слабым приятным запахом и горьковатым слегка вяжущим вкусом, хорошо растворимый в горячей воде.

Параметры стандартизации конечного продукта - экстракта сухого.

Обнаружение флавоноидов и фенолкарбоновых кислот проводили методом ВЭЖХ на приборе Gilston. Навеску ЭСВК около 0,0200 г, растворяли в 10 мл 70% спирта этилового. В хроматограф вводили по 20 мкл исследуемого раствора и стандартных веществ. Условия хроматографирования: колонка Kromasil С18 (4,6×250 мм; 5 мкм); режим элюирования - изокритический; элюент - ацетонитрил-вода-кислота фосфорная конц. в соотношении 20:80:0,05. Идентифицированы флавоноиды (кверцетин, лютеолин-7-глюкозид, гиперозид, рутин, апигенин), фенолкарбоновые кислоты (кофейная, хлорогеновая, галловая, цикориевая, феруловая, розмариновая).

Количественное определение суммы флавоноидов.

Около 0,1 г (точная навеска) ЭСВК помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70% спирта этилового, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем раствора доводят 70% спиртом этиловым до метки, перемешивают (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют 1 мл 1% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят раствор до метки 96% спиртом этиловым. Через 40 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре «LEKI SS 1207» (Финляндия) при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А, 1 капли 10% раствора кислоты уксусной и доведенный 96% спиртом этиловым до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора РСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухой экстракт в процентах (X) вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D₀ - оптическая плотность раствора РСО рутина; m - масса экстракта, г; m₀ - масса РСО рутина, г; W - потеря в массе при высушивании экстракта в процентах.

Примечание. Приготовление раствора РСО рутина: около 0,05 г (точная навеска) РСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 96% спирта этилового в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.

Содержание суммы флавоноидов в ЭСВК 19,39%.

Методика количественного определения суммы фенолкарбоновых кислот в ЭСВК.

1 мл раствора А (полученного для количественного определения содержания суммы флавоноидов) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора 96% спиртом этиловым до метки.

Оптическую плотность раствора определяют на спектрофотометре «LEKI SS 1207» (Финляндия) при длине волны 325 нм в кювете с длиной рабочего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют 96% спирт этиловый.

Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на кофейную кислоту и

воздушно-сухой экстракт в процентах (X) рассчитывают по формуле:

,

где D - оптическая плотность испытуемого раствора; m - масса сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %; 782 - удельный показатель поглощения кофейной кислоты при 325 нм.

Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в ЭСВК 12,03%.

Влажность ЭСВК 3,80%.

Желчегонная активность.

Исследования выполнены на крысах линии Wistar обоего пола массой 190-200 г, содержащихся на стандартном рационе питания при свободном доступе к воде и пище в условиях вивария. Исследования с животными проводились в соответствии с «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей».

Исследование желчегонной активности проводили по общепринятой методике Скакуна Н.П. и Олейник А.Н. [9]. Препараты вводили per os. ЭСВК в дозе 100 мг/кг в виде водного раствора в объеме 2 мл. Препаратом сравнения служил настой цветков бессмертника песчаного 1:10 в объеме 2 мл. Крысы контрольной группы получали воду очищенную в эквиобъемном количестве. О степени желчегонной активности исследуемых средств судили по скорости секреции желчи, общему ее объему, а также по количеству содержания в желчи билирубина, холестерина, желчных кислот (по стандартным наборам Лахема, Чехия). Результаты эксперимента статистически обрабатывали.

ЭСВК повышал скорость секреции желчи, начиная с первого часа и далее по сравнению с контролем. Общее количество выделенной желчи при введении ЭСВК превышает достоверно контроль на 32,9% (табл. 7).

ЭСВК обладает выраженной желчегонной активностью и не уступает экстракту сухому зубчатки обыкновенной в адекватной дозе (100 мг/кг) и настою цветков бессмертника песчаного (1:10).

По содержанию в желчи билирубина, холестерина и желчных кислот ЭСВК превосходит сухой экстракт зубчатки обыкновенной, что объясняется более высоким содержанием основных БАВ в экстракте (флавоноидов и фенолкарбоновых кислот).

Противовоспалительная активность.

В эксперименте использовали методики исследования противовоспалительной активности на разных стадиях процесса воспаления: альтерации - по И.А. Ойвину [5], экссудации - по Ю.Е. Стрельникову [11], пролиферации - Ф.Н. Тринусу [12]. ЭСВК вводили крысам энтерально в виде водного раствора в дозе 100 мг/кг веса крысы, крысы контрольной группы получали воду очищенную в объеме 1 мл.

О воздействии ЭСВК на альтерацию тканей и интенсивность процессов регенерации судили по динамике заживления кожно-мышечного дефекта у крыс, вызванного подкожным введением в область спины 0,5 мл 9% кислоты уксусной с одновременным введением раствора декстрана в дозе 300 мг/кг массы животного. Первое введение препаратов осуществляли за 1 ч до введения уксусной кислоты, затем ежедневно 1 раз в сутки в течение 29 дней. На 9 и 29 сутки эксперимента оценивали площадь некротизированной ткани путем нанесения контура некроза на прозрачную пленку.

Оценку влияния ЭСВК на экссудативную фазу воспаления проводили путем однократного введения в заднюю конечность животных 0,1 мл 3% формалина. Исследуемые препараты вводили за 1 ч до инъекции, а затем через 5 и 18 часов. Оценку антиэкссудативной активности определяли путем расчета процента угнетения отека к контролю.

При изучении процесса образования фиброзно-грануляционной ткани стерильные ватные шарики массой 15 мг имплантировали крысам под кожу в области спины в асептических условиях. Изучаемые препараты вводили 1 раз в сутки в течение 7 дней. Затем образовавшиеся гранулемы взвешивали на аналитических весах сразу после извлечения и после высушивания (при 70°С в течение 24 ч до постоянной массы).

Результаты эксперимента статистически обрабатывали при доверительной вероятности 95%.

Как видно из таблицы 8, ЭСВК в дозе 100 мг/кг оказывает противовоспалительное действие, о чем свидетельствуют уменьшение степени альтерации ткани и повышение интенсивности процессов регенерации в очаге воспаления. Площадь повреждения тканей на 9 и 29 день уменьшается на 54,14% и 74,54%) соответственно.

Испытанная доза ЭСВК оказывает антиэкссудативное действие, снижая отек лапки животных на 31,91% по сравнению с контрольной группой (табл. 9).

Результаты изучения влияния исследуемых препаратов на стадию пролиферации представлены в таблице 10.

Процент стимуляции образования гранулемы под влиянием ЭСВК составляет 23,3%. Стимуляция образования гранулемы экстрактом сухим возрастает по сравнению с контролем в 1,2 раза.

Антиоксидантная активность.

Определение антиоксидантной активности ЭСВК проводили in vitro на сыворотке донорской крови человека. К 2 мл сыворотки прибавляли 1 мл 10% раствора ЭСВК (на физиологическом растворе). Далее добавляли 0,1 мл 0,5 М раствора сульфата меди (II), в качестве индуктора ПОЛ, и инкубировали при t=37°C в течение 16 ч. В контрольном опыте вместо тест-препарата прибавляли 1 мл 0,05 М раствора этилендиаминтетрацетата (ЭДТА) как ингибитора ПОЛ [15].

Определяли содержание ДК и МДА [1].

ЭСВК снижал образование ДК в сравнении с контролем на 66,9%, МДА на 79,4% (табл. 11), что свидетельствует об антиоксидантной активности предлагаемого средства и превосходит позитивный контроль на 30,0%) и 61,6%) соответственно.

Литература

1. Гончаренко, М.С. Метод оценки перекисного окисления липидов / М.С. Гончаренко, A.M. Латинова // Лабораторное дело. - 1985. - №1. - С. 60-61.

1. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Т.2. -М., 2015. -1004 с. Электронный ресурс] URL:

http://pharmacopoeia.ru/ofs-l-5-3-0003-15-tehnika-mikroskopicheskogo-i-mikrohimicheskogo-issledovaniya-lekarstvennogo-rastitelnogo-syrya-i-lekarstvennyh-rastitelnyh-preparatov/.

2. Государственный реестр лекарственных средств по состоянию на 02.05.2017 [Электронный ресурс] URL: http://grls.rosminzdrav.ru

3. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия: учеб. пособие / под ред. Г.П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. - СПб.: СпецЛит, 2004. - 765 с.

4. Ойвин, И.А. Методика изучения местных нарушений капиллярной проницаемости / И.А. Ойвин, С.Л. Шетель // Материалы по патогенезу воспаления и патологии белков крови. - Душанбе, 1961. - Т. 49, №5. -С. 167-173. Растительные ресурсы СССР: цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Hydrangeaceae-Haloragaceae. - СПб., 1991. - С. 101

5. Петухова, С.А. Фармакогностическое исследование надземных органов володушки козелецелистной (Bupleurum scorzoneri folium willd.), произрастающей в Восточной Сибири / С.А. Петухова, В.М. Мирович // Сборник материалов IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» - Санкт-Петербург, 2016. - С. 486 - 489.

6. Ронжин, И.В. Статистика заболеваний желудочно-кишечного тракта:

причины, симптомы, профилактика / И.В. Ронжин, Е.А. Пономарева// Молодой ученый. -2015. - №25 (103). - С. 375-379

7. Самылина, И.А. Перспективы создания сухих экстрактов / И.А. Самылина [и др.] // Фармация. - 2006. - №2 - С. 43-46

8. Скакун, Н.П. Сравнительное действие атропина и метацина на внешнесекреторную функцию печени / Н.П. Скакун, А.Н. Оленник // Фармакология и токсикология. - 1967. - Т. 30. - №3. - С. 334 - 337.

9. Соколов, С.Я. Фитотерапия и фитофармакология / С.Я. Соколов. - М.: МИА, 2000. - 973 с

10. Стрельников, Ю.С. Сравнительная характеристика противовоспалительного действия некоторых пиримидиновых производных /Ю.С. Стрельников // Фармакология и токсикология. -1960. - №6 - С. 167-173.

11.Тринус, Ф.П. Нестероидные противовоспалительные средства / Ф.П. Тринус, Н.А. Мохорт, Б.М. Клебанов. - Киев, 1975. - 240 с

12. Флора Центральной Сибири. / под ред. П.И. Малышева, Г.А. Пешковой. - Новосибирск: Наука, 1979. - С. 676.

13. Чудновская, Г.В. Володушка козелецелистная (Bupleurum scorzonerifolium Willd.) в Восточном Забайкалье / В.Г. Чудновская // Вестник ТГПУ. - 2013. - №8. - С. 43.

14.Шаварда, А.Л. Антиоксидантная активность видов флоры Алтая / А.Л. Шаварда и [др.] // Растит. ресурсы. - 1998. - т. 34. - вып. 2. - С. 1-8.

* в таблице приведены данные среднего значения 3-х определений

Примечание: К-контроль (вода очищенная); ПК-позитивный контроль (ЭДТА).