Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИЗАТА РЫБНОГО КОЛЛАГЕНА

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, касается способа получения гидролизата морского коллагена (молекулярная масса ниже 15 кДа), который может быть использован в пищевой, косметической, медицинской и других отраслях промышленности для получения медицинских и косметических препаратов, а также некоторых продуктов питания.

Коллаген составляет основу тканей многих живых организмов, в том числе человека. Хронический недостаток коллагена приводит к проблемам практически всех органов и тканей, и прежде всего кожи, костно-суставного аппарата, волос, ногтей, а также вызывает нарушение структуры сосудов и зрения. Коллаген активно стимулируют секретную и двигательную функции желудка и кишечника, оказывает благотворное влияние на состояние и функцию полезной кишечной микрофлоры (http://7vlife.ru/info/articles/rol-kollagena-v-organizme-cheloveka/).

В последнее время коллагенсодержащие препараты находят самое широкое применение в медицине, косметологии, фармакологии. Источником коллагена являются, чаще всего, отходы пищевой промышленности, т.к. коллаген содержится в коже, сухожилиях, хрящах и т.п. В течение продолжительного периода во всех сферах использовался коллаген животного происхождения. С начала текущего века приоритетные позиции переходят коллагену, выделенному из гидробионтов, чаще всего, из отходов переработки морских рыб, так называемому «морскому коллагену». Он имеет целый ряд преимуществ в сравнении с аналогом животного происхождения. Это, в первую очередь, большее структурное сходство с коллагеном человека, обеспечивающее биосовместимость. Уровень усвоения организмом коллагена из рыбы в 1,5 раза выше коллагена, получаемого из шкуры свиньи. Важное значение имеют антигенность, способность к биодеградации (http://camucamu.ru).

В то же время хорошим стимулом для развития новых технологий получения коллагена является актуальная экологическая задача - рациональное использование белоксодержащих отходов переработки рыбной продукции. В настоящее время производство рыбной продукции сопровождается образованием большого количества вторичного белоксодержащего сырья (кости, плавники, кожа, чешуя, внутренности и т.д.), составляющего от 30 до 70% от массы исходного сырья, не находящего своего применения с сохранением биоактивного функционала [Воробьев, В.И. Использование рыбного коллагена и продуктов его гидролиза / В.И. Воробьев // Известия КГТУ. - 2008. - №13. - С. 55-58]. Белоксодержащие материалы являются источником коллагена

Следует обратить внимание на то, что на сегодняшний день существует ряд способов выделения гидролизата коллагена, представленных как в научных публикациях, так и в патентах. Необходимо особый акцент сделать на значениях молекулярной массы (ММ) выделяемого коллагена, которая контролируется различными методами, чаще всего такими как ГПХ, электрофорез, МАЛДИ. В зависимости от метода определения количественная величина ММ может немного изменяться. Однако в целом можно сказать, что высокомолекулярный коллаген имеет ММ 200 кДа, гидролизат (низкомолекулярный) коллаген ≤15 кДа. При этом немаловажное значение имеет коэффициент полидисперсности (отношение среднемассовой и среднечисленной молекулярной масс), характеризующий «разброс» значений ММ коллагена. На практике использование совокупности приемов позволяет получать узкодисперсный высокомолекулярный коллаген, гидролизат коллагена значением ММ ниже порогового значения и коллаген с широким диапазоном ММ, начиная с высокомолекулярного и заканчивая гидролизатом (низкомолекулярным). Значительным преимуществом гидролизата (низкомолекулярного) коллагена перед высокомолекулярным или коллагеном с широким диапазоном ММ является способность более эффективно поглощаться как в пищеварительном тракте, так и органами покровной системы человека: кожей, волосами, ногтями (http://japanvitamins.ru/print_product_info.php/products_id/27).

Наиболее применимыми для выделения низкомолекулярного коллагена в настоящее время являются методы химического (щелочного, щелочно-солевого, кислотного) и ферментативного гидролиза. В последнем случае используют протеолитические ферментные препараты, а также комплексные добавки, содержащие несколько ферментов.

Известен способ получения гидролизата коллагена, связанный с последовательной обработкой подготовленного сырья (медуза) растворами органической кислоты, щелочи, ферментным препаратом алкалаза, затем нейтрализацию органической или соляной кислотой. Температура гидролиза 40°C. (см. RU 2094999).

Известен способ щелочного гидролиза отходов кожевенного и мехового производства (RU 2375385 C1, C08H 1/06, опубл. 30.01.2015 г.), в котором описан ферментативный способ выделения гидролизата коллагена из кожи или сухожилий млекопитающих, а также способ ферментативного гидролиза отходов жиловки мяса (RU 2409216 C1, кл. A23J 1/10, опубл. 20.01.2011 г.).

Недостатками методов являются отсутствие как входного контроля для сырья, так и параметров выделяемого коллагена: ММ, зольность и.т.п.

Известен способ получения гидролизата коллагена, в котором сырье (промытые кишки, каныга или кожный покров млекопитающих и птиц, а также плавательные пузыри гидробионтов и рыб, отделенных от сопутствующих им белков), содержащее коллаген, предполагающий замачивание измельченного сырья в холодной воде, затем в растворе поваренной соли, нагревании до 40°C, обработку липазой для расщепления жиров, промывание, растворение в растворе поваренной соли и обработку протеазой при 40°C для получения гидролизата. По окончании обработки смесь высушивают в вакууме (RU 2272808).

Недостатком данного способа является многостадийность, использование большого количества реагентов и присутствие в гидролизате коллагена примесей высокомолекулярного коллагена.

Известен способ получения гидролизата коллагена ферментативным гидролизом желатина при последовательном воздействии друг за другом двух эндопептидаз с различной специфичностью, причем в качестве первого фермента используют эндопептидазу из Bacillussubtilis или из Bacillusamyloliquefaciens, а в качестве второго фермента используют эндопептидазу из Bacilluslicheniformis (патент RU 277699).

Недостатками данного способа являются многостадийность и использование продукта денатурации коллагена - желатина.

Известен способ (патент RU 2360693) получения гидролизата рыбного коллагена из остатков мяса рыбы на костных скелетах лосося после филетирования ферментативным гидролизом с использованием Protamex™ (комплекс протеаз Bacillus от Novozymes AS (Bagsvaerd, Denmark) при pH примерно 6,5 и при температуре ~ 55°C.

Недостатками данного способа являются получение коллагена с высоким содержанием золы и отсутствие описания важных параметров коллагена, таких как жирность, ММ и т.п.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ обработки коллагенсодержащего сырья, защищенный патентом RU 2501812 C2, кл. C08B 37/08, A61K 35/60, A61K 38/39, A61K 31/728, C12N 9/14, принятый за ближайший аналог (прототип).

В способе по прототипу сырье - шкуры прудовых рыб - промывают холодной проточной водой в течение 10-15 мин, измельчают их до размера 2-3 мм, проводят водную экстракцию при температуре 40-45°C в течение 40-50 мин при соотношении измельченные шкуры : вода равном 1:1 при периодическом перемешивании, фильтруют, твердую фракцию подвергают отбеливанию перекисно-солевым раствором, взятым таким образом, чтобы вся твердая фракция была покрыта перекисно-солевым раствором, который готовят путем смешивания 3%-ной перекиси водорода с хлоридом натрия, из расчета: на 1 л 3%-ной перекиси водорода вносится 20 г хлорида натрия, процесс ведут в течение 12 часов, по истечении указанного времени перекисно-солевой раствор сливают, затем отбеленную твердую фракцию подвергают набуханию в 1,0-1,2%-ном растворе гидроксида натрия, взятом в соотношении 1:1 к массе твердой фракции, 24 ч при температуре 20-25°C с последующей нейтрализацией полученной смеси 3%-ным раствором борной кислоты, далее осуществляют обработку набухшей твердой фракции раствором ферментного препарата «Панкреатин» (например, «Панкреатин» Ирбитского химфармзавода, Россия, по данным производителя - субстанция-порошок аморфный с энзимной активностью: протеолитической - 200 ФИП единиц (ME ферментативной активности), амилолитической - 3500 ФИП единиц, литической – 4300 ФИП единиц), взятым в количестве 0,5-0,6%) к массе твердой фракции, в течение 1,5-2,0 ч при температуре 37-40°C, причем ферментный препарат готовят путем его смешивания с водой в соотношении 1:3. Далее проводят промывку твердой фракции холодной проточной водой для удаления остатков «Панкреатина», полученный коллаген, в зависимости от назначения, направляют на сушку в сушильные камеры с принудительной циркуляцией воздуха при температуре 18-20°C в течение 12 ч и хранение в сухие вентилируемые помещения при температуре не выше 20°C в течение 24 месяцев, или замораживают до температуры минус 18 - минус 20°C и хранят при температуре минус 18 - минус 20°C в течение 24 месяцев, высушенную в распылительной сушилке жидкую фракцию хранят при температуре 0-4°C в течение 12 месяцев или растворяют в физиологическом буферном растворе.

Преимуществом и общим признаком с предлагаемым изобретением является использование для получения низкомолекулярного гидролизата коллагена ферментов, участвующих в расщепление высокомолекулярных белков в организме человека, что значительно снижает риск попадания в организм человека посторонних веществ при употреблении вовнутрь.

Недостатком способа по прототипу является многостадийность процесса и отсутствие контроля качества входного для сырья и конечного для гидролизата.

Задачей изобретения является создание нового способа получения гидролизата рыбного коллагена, пригодного для получения жидких субстанций, порошков, пленок для самого широкого использования пищевой, косметической, медицинской и других отраслях промышленности с применением доступных протеолитических ферментов.

Техническим результатом от использования предлагаемого изобретения получение гидролизата коллагена с со значением среднечисленной ММ<15 кДа с преимущественным содержанием коллагена со среднечисленной ММ≤7 кДА и параметрами:

влажность (макс., %) - 7,0,

зольность (макс., %) - 2,0,

жиры (макс., %) - 0,3,

РН (10% раствор) - 5,5-6,5,

растворимость в воде - полная,

просеивание - очень быстрое,

энзиматическая активность - отсутствие,

вид раствора - незначительная замутненность,

цвет порошка: цвет слоновой кости,

запах и вкус - нейтральные.

Это достигается тем, что способ получения гидролизата коллагена, включает подготовку и анализ сырья, в качестве которого используют шкуры промысловых рыб, ферментативное выделение гидролизата коллагена, получение кислой дисперсии гидролизата коллагена, формирование сухой формы гидролизата коллагена, при этом подготовку сырья осуществляют путем очистки рыбьих шкур, промывки их водой, замораживания, измельчения и перемешивания, анализ сырья осуществляют путем контроля содержания в сырье влаги, золы и жира, причем используют гомогенизированный продукт, содержащий не более 55% воды, не более 3% золы и менее 1% жира, ферментативное выделение гидролизата коллагена осуществляют путем промывки подготовленного гомогенизированного продукта водой, заливки 1-3%-ным раствором протеолитического ферментного препарата при гидромодуле 1:2-1:5, выдерживание в течение 5 часов, фильтрацию продукта от примесей, получение кислой дисперсии осуществляют путем подкисление раствора раствором уксусной кислоты до pH 5,5-6,5, формирование сухой формы осуществляют путем испарения воды из фильтрата без нагрева при температуре выше 50°C; в качестве протеолитического препарата используют протеолитический фермент коллагеназы, или протеолитический фермент панкреатина, или протеолитический фермент пепсина; обработку панкреатином проводят дробно в течение 5 через каждые 30 мин, разделив на порции пропорционально; испарение воды осуществляют лиофильно или распылительной сушкой в зависимости от назначения сухой формы.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Способ получения гидролизата коллагена включает следующие этапы:

1) подготовку и анализ сырья;

2) ферментативное выделение гидролизата коллагена;

3) получение кислой дисперсии гидролизата коллагена;

4) формирование «сухой» формы продукта.

Сначала осуществляют подготовку и анализ сырья. В качестве сырья используют шкуры промысловых рыб. Их очищают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт анализируют на содержание влаги, золы и жира по общепринятым методикам. Для дальнейших манипуляций используют гомогенизированный продукт, содержащий не более 55% воды, не более 3% золы и менее 1% жира.

Предварительно взвешенный гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 минут, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают 1-3%-ным раствором протеолитического фермента, например панкреатина, или пепсина, или коллагеназы, при гидромодуле от 1:2 до 1:5 в зависимости от необходимой концентрации коллагена в растворе. Обработку панкреатином проводят дробно, что позволяет добиться максимального выхода гидролизата коллагена. Затем продукт фильтруют от примесей.

Для получения жидкой субстанции раствор подкисляют раствором уксусной кислоты до pH 5,5-6,5.

Для получения сухих форм воду из фильтрата испаряют любым способом без нагрева выше 50°C (лиофильная, распылительная сушка) в зависимости от назначения сухой формы (порошок, пленка).

Выделенный предлагаемым способом гидролизат коллагена имеет значения среднечисленной молекулярной массой ММ<15 кДа с преимущественным содержанием коллагена со среднечисленной молекулярной массой ММ≤7 кДА.

Параметры выделенного коллагена:

влажность (макс., %) - 7,0,

зольность (макс., %) - 2,0,

жиры (макс., %) - 0,3,

РН (10% раствор) - 5,5-6,5,

растворимость в воде – полная,

просеивание - очень быстрое,

энзиматическая активность – отсутствие,

вид раствора - незначительная замутненность,

цвет порошка: цвет слоновой кости,

запах и вкус - нейтральные.

Пример 1

Шкуру трески очищают, взвешивают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт содержит влаги (61,2%), золы (1,0%) и жира (1,0%). Гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 минут, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают 2%-ным раствором протеолитического фермента панкреатина при гидромодуле 1:2. Обработку панкреатином проводят дробно в течение 5 ч через каждые 30 мин, разделив на порции пропорционально. Затем продукт фильтруют от примесей. Для получения жидкой субстанции раствор подкисляют раствором уксусной кислоты до 3%.Для анализа параметров коллагена из раствора испаряют воду лиофильно. Выделен гидролизат коллагена (среднечисленная ММ≤15 кДа), ~ 80% которого имеют среднечисленную ММ≤7 кДа.

Параметры выделенного коллагена:

влажность - 2,0%,

зольность - 0,9%,

жиры - 0,2%,

РН (10% раствор) - 5,5,

растворимость в воде – полная,

энзиматическая активность – отсутствие,

вид раствора - незначительная замутненность,

цвет: цвет слоновой кости,

запах и вкус - нейтральные.

Пример 2

Шкуру трески очищают, взвешивают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт содержит влаги (61,4%), золы (1,1%) и жира (1,0%). Гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 минут, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают 1%-ным раствором протеолитического фермента пепсина при гидромодуле 1:2и выдерживают в течение 5 ч. Затем продукт фильтруют от примесей, воду испаряют лиофильно. Выделен гидролизат коллагена (среднечисленная ММ≤15 кДа) ~ 90% которого имеют среднечисленную ММ≤7 кДа.

Параметры выделенного коллагена:

влажность - 2,1%,

зольность - 1,1%,

жиры - 0,2%,

РН (10% раствор) - 5,5,

цвет: цвет слоновой кости,

запах и вкус – нейтральные,

растворимость в воде - полная.

Пример 3

Шкуру лосося очищают, взвешивают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт содержит влаги (64,7%), золы (1,3%) и жира (1,8%). Гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 минут, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают 3 %-ным раствором протеолитического фермента коллагеназы при гидромодуле 1:2и выдерживают в течение 5 ч. Затем продукт фильтруют от примесей, воду испаряют распылительной сушкой. Выделен гидролизат коллагена (среднечисленная ММ≤15кДа), более 90% которого имеют среднечисленную ММ≤7 кДа.

Параметры выделенного коллагена:

влажность - 2,1%,

зольность - 1,1%,

жиры - 0,2%,

РН (10% раствор) - 5,5,

растворимость в воде – полная,

запах и вкус – нейтральные,

просеивание - очень быстрое.

Пример 4

Шкуру трески очищают, взвешивают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт содержит влаги (61,6%), золы (1,3%) и жира (1,5%). Гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 минут, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают3 %-ным раствором протеолитического фермента коллагеназы при гидромодуле 1:5 и выдерживают в течение 5 ч. Затем продукт фильтруют от примесей. Для получения жидкой субстанции раствор подкисляют раствором уксусной кислоты до 3%.Для анализа параметров коллагена из раствора испаряют воду лиофильно. Выделен гидролизат коллагена (среднечисленная ММ≤15 кДа), ~ 90% которого имеют среднечисленную ММ≤7 кДа.

Параметры выделенного коллагена:

влажность - 2,0%,

зольность - 0,9%,

жиры - 0,2%,

РН (10% раствор) - 5,5,

растворимость в воде – полная,

просеивание - очень быстрое,

энзиматическая активность – отсутствие,

вид раствора - незначительная замутненность,

цвет порошка: цвет слоновой кости,

запах и вкус - нейтральные.

Пример 5

Шкуру трески очищают, взвешивают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт содержит влаги (61,2%), золы (1,1%) и жира (1,4%). Гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 минут, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают 3%-ным раствором протеолитического фермента пепсина при гидромодуле 1:2 и выдерживают в течение 5 ч. Затем продукт фильтруют от примесей. Для получения жидкой субстанции раствор подкисляют раствором уксусной кислоты до 3%.Для анализа параметров коллагена из раствора испаряют воду лиофильно. Выделен гидролизат коллагена (среднечисленная ММ≤15 кДа), ~ 80% которого имеют среднечисленную ММ≤7 кДа.

Параметры выделенного коллагена:

влажность - 2,0%,

зольность - 0,9%,

жиры - 0,2%,

РН (10% раствор) - 5,5,

растворимость в воде – полная,

просеивание - очень быстрое,

энзиматическая активность – отсутствие,

вид раствора - незначительная замутненность,

цвет порошка: цвет слоновой кости,

запах и вкус - нейтральные.