ТРИТЕРПЕНОВЫЕ АМИДЫ ЛУПАНОВОГО ТИПА С ФРАГМЕНТОМ 2-АМИНОБУТАН-1-ОЛА, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ВИРУСИНГИБИРУЮЩУЮ И ВИРУЛИЦИДНУЮ АКТИВНОСТЬ

Изобретение относится к новым химическим соединениям класса лупановых тритерпеноидов, проявляющим вирулицидную и вирусингибирующую активность.

Среди социально значимых заболеваний ВИЧ-инфекция и инфекции, вызванные вирусами герпеса, занимают одно из ведущих мест в силу повсеместного распространения и различных путей передачи вирусов. Действие современных противовирусных препаратов в основном направлено на ингибирование стадии размножения вирусов. Персистирующий характер данных инфекций обусловливает появление штаммов вирусов, резистентных к применяемым в клинической практике лекарственным средствам. В настоящее время наряду с разработкой новых противовирусных препаратов для эффективного лечения вирусных инфекций, в том числе вызванных лекарственно устойчивыми штаммами вирусов, актуален поиск микробицидных агентов, способных предотвращать инфицирование при контакте с вирусными частицами, в том числе с вирусами иммунодефицита человека и герпеса простого I типа.

Перспективной основой для разработки новых противовирусных агентов являются природные полициклические тритерпеноиды лупанового типа, в частности, бетулин и его производные бетулоновая и бетулиновая кислоты [Betulinic acid and its derivatives: a patent review (2008-2013) / R. Csuk // Expert Opinion Therapeutic Patents - 2014. - Vol. 24. - No. 8. - P. 1-11], а также их А-секо-производные [Synthesis and antiviral activity of 2,3-seco-derivatives of betulonic acid / I.A. Tolmacheva, V.V. Grishko, E.I. Boreko, O.V. Savinova, and N.I. Pavlova // Chemistry of Natural Compounds. - 2009. - Vol. 45 - No. 5 - P. 673-676]. Описываемым соединениям наиболее близки по структуре синтезированные недавно [Synthesis and antiviral activity of C-3(C-28)-substituted 2,3-seco-triterpenoids / I.A. Tolmacheva, E.V. Igosheva, O.V. Savinova, E.I. Boreko, and V.V. Grishko // Chemistry of Natural Compounds. - 2014. - Vol. 49. - No. 6. - P. 1050-1058] моно- и диамидные производные 2,3-секолупановых кислот, среди которых лишь N-[1-циано-2,3-секо-2-норлуп-20(29)-ен-3-аль-28-оил]-2-аминопропан-1,3-диол и N,N'-[1-циано-2,3-секо-2-норлуп-20(29)ен-3,28-диоил]ди-2-аминопропан-1,3-диол обладали высокой (ЕС₅₀ 5,7 и 14,4 мкМ, МПК/ЕС₅₀ 32,2 и 11,1 соответственно) вирусингибирующей активностью в отношении вируса герпеса простого I типа (ВГП-1). Выраженные анти-ВГП-1 свойства обнаружены у этил-N-[1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-оил]-β-аланината (ЕС₅₀ 4,9 мкг/мл, МПК/ЕС₅₀ 40,8), в то время как диэтил-N,N'-(1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3,28-диоил)ди-β-аланинат сочетал высокую ингибирующую активность в отношении ВГП-1 и ВИЧ-1 (ЕС₅₀ 3,0 и 3,8 мкг/мл, МПК/ЕС₅₀ 16,7 и 13,2 соответственно) [Лупановые А-секотритерпеноиды, проявляющие противовирусную активность / И.А. Толмачева, В.В. Гришко, Е.В. Игошева, Е.И. Бореко, В.Ф. Еремин, И.И. Кучеров, О.В. Савинова // Патент РФ. - №2470003 - 20.12.2012. - Бюл. №35].

Задача настоящего изобретения - синтез новых тритерпеновых производных, представляющих интерес в качестве агентов с вирулицидным и вирусингибирующим действием в отношении вирусов ВГП-1 и ВИЧ-1 и/или интермедиатов для их синтеза.

Для решения поставленной задачи синтезированы:

1. Лупановые и 2,3-секолупановые С28 амиды с фрагментом 2-аминобутан-1-ола общей формулы:

или или

или или

где , R¹=(R)-(-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R)-(-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R)-(-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол.

2. Соединения по п. 1, где , R¹=(R)-(-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R)-(-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R, S)-(+/-)-2-бутан-1-ол, проявляющие ингибирующую активность в отношении ВГП-1.

3. Соединение по п. 1, где , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол, проявляющие вирулицидную активность в отношении ВГП-1.

4. Соединение по п. 1, где , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол, или , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол, проявляющее вирулицидную активность в отношении ВИЧ-1.

Получены соединения общей формулы, где , R¹=(R)-(-)-2-бутан-1-ол (соединение I); , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол (соединение II); , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол (соединение III); , R¹=(R)-(-)-2-бутан-1-ол (соединение IV); , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол (соединение V); , R¹=(R,S)-(+/-)-2-абутан-1-ол (соединение VI); , R¹=(R)-(-)-2-бутан-1-ол (соединение VII); , R¹=(S)-(+)-2-бутан-1-ол (соединение VIII) и , R¹=(R,S)-(+/-)-2-бутан-1-ол (соединение IX).

Синтезированные соединения представляют собой мелкокристаллические вещества белого цвета, хорошо растворимые в хлороформе, дихлорметане, четыреххлористом углероде, этиловом спирте, бензоле, толуоле, диметилсульфоксиде, плохо растворимые в гексане и нерастворимые в воде.

Синтез соединений I-IX проводили способом, включающим взаимодействие хлорангидридов 3-оксолуп-20(29)-ен-28-овой (для соединений I-III), или 3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-овой (для соединений IV-VI), или 1-циано-2,3-секо-2-норлуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой (для соединений VII-IX) кислот в безводном дихлорметане с соответствующими (R)-(-)-, или (S)-(+)-изомером (Alfa Aesar, 98%), или (R,S)-(+/-)-рацемической смесью (Acros Organics, 97%) 2-аминобутан-1-ола в присутствии триэтиламина.

Структура заявляемых соединений подтверждена методами ИК и ЯМР спектроскопии. Спектральные характеристики соединений I-IX приведены в таблице 1. ИК-спектры (v, см^-1) регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре IFS 66/S Bruker (Германия) в пленке с хлороформом. Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соединений I-VI записывали на ЯМР-спектрометре Bruker AVANCE II (400 и 100 МГц соответственно) в растворе CDCl₃. Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соединений VII-IX записывали для растворов в CDCl₃ на спектрометре «Varian Mercury+» (США) при рабочей частоте прибора 300 или 75.5 МГц. Пороговое значение температуры в точке плавления при скорости нагрева 1°С/мин определяли на приборе OptiMelt МРА100 (США). ТСХ-анализ проводили на пластинах Sorbfil (Россия) в системе хлороформ-метанол. Обнаружение веществ осуществляли обработкой 5% H₂SO₄ с последующим прогреванием пластины при 95-100°С в течение 2-3 мин. Для колоночной хроматографии использовали силикагель 60-200 μm марки Merck (Германия), элюент для каждого соединения подбирали индивидуально.

Заявляемые соединения in vitro проявляют вирусингибирующую и вирулицидную активность в отношении ВГП-1 и вирулицидную активность в отношении ВИЧ-1 и представляют интерес в качестве противовирусных и/или микробицидных агентов, а также могут быть использованы в качестве интермедиатов для получения новых соединений с противовирусными свойствами.

Описания заявляемых соединений и их свойств в источниках информации не обнаружено.

Сущность предлагаемого решения и возможность его осуществления подтверждается примерами 1-13 и результатами исследований, приведенными в таблицах 1-3.

Пример 1. Получение N-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2(R)-аминобутан-1-ола (соединение I).

К раствору 1,1 ммоль 3-оксолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты (бетулоновая кислота) в 10 мл безводного хлористого метилена в атмосфере аргона добавляли 2,2 ммоль (0,2 мл) оксалилхлорида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 6 ч. Растворитель отгоняли досуха в вакууме водоструйного насоса при температуре водяной бани 30°C. К остатку добавляли 10 мл безводного хлористого метилена, растворитель отгоняли. Процедуру повторяли трижды. К суспензии полученного таким образом хлорангидрида бетулоновой кислоты в 10 мл безводного дихлорметана в атмосфере аргона добавляли 1,2 ммоль (R)-(-)-2-аминобутан-1-ола и 1,2 ммоль (0,17 мл) триэтиламина. Реакционную смесь в течение 4-6 ч перемешивали при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляли методом ТСХ. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. Выход 43%. R_f 0,44 (хлороформ : метанол 20:1). Т. пл. 140,1°С (гексан-этилацетат). (с 0,36, CHCl₃).

Пример 2. N-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2(S)-аминобутан-1-ол (соединение II) получали по методике, описанной в примере 1, используя (S)-(+)-2-аминобутан-1-ол. Выход 50%. R_f 0,41 (хлороформ:метанол 20:1). Т. пл. 166,0°С (гексан-этилацетат). (с 0,35, CHCl₃).

Пример 3. N-[3-оксо-20(29)-лупаен-28-оил]-2(R,S)-аминобутан-1-ол (соединение III) получали по методике, описанной в примере 1, используя (R,S)-(+/-)-2-аминобутан-1-ол. Выход 53%. R_f 0,53 (хлороформ:метанол 20:1). Т. пл. 121,4°С (гексан-этилацетат). (с 0,4, CHCl₃).

Пример 4. N-[3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оил]-2(R)-аминобутан-1-ол (соединение IV) получали по методике, описанной в примере 1, используя в качестве базового соединения 3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-овую кислоту (бетулиновая кислота). Выход 30%. R_f 0,43 (хлороформ:метанол 20:1). Т. пл. 166,4°С (гексан-этилацетат). (с 0,2, CHCl₃).

Пример 5. N-[3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оил]-2(S)-аминобутан-1-ол (соединение V) получали по методике, описанной в примере 4, используя (S)-(+)-2-аминобутан-1-ол. Выход 28%. R_f 0,45 (хлороформ-метанол 20:1). Т. пл. 202,2°С (гексан-этилацетат). (с 0,34, CHCl₃).

Пример 6. N-[3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оил]-2(R,S)-аминобутан-1-ол (соединение VI) получали по методике, описанной в примере 4, используя (R,S)-(+/-)-2-аминобутан-1-ол. Выход 52%. R_f 0,48 (хлороформ-метанол 20:1). Т. пл. 209,0°С (гексан-этилацетат). (с 0,24, CHCl₃).

Пример 7. N-[1-циано-2,3-секо-2-норлуп-20(29)-ен-3-аль-28-оил]-2(R)-аминобутан-1-ол (соединение VII) получали по методике, описанной в примере 1, используя в качестве базового соединения 1-циано-2,3-секо-2-норлуп-20(29)-ен-3-аль-28-овую кислоту. Выход 38%. R_f 0,31 (гексан-этилацетат 1:1). Т. пл. 140,0°С (гексан-этилацетат). (с 0,1, CHCl₃).

Пример 8. N-[1-циано-2,3-секо-2-норлуп-20(29)-ен-3-аль-28-оил]-2(S)-аминобутан-1-ол (соединение VIII) получали по методике, описанной в примере 7, используя (S)-(+)-2-аминобутан-1-ол. Выход 49%. R_f 0,33 (гексан-этилацетат 1:1). Т. пл. 212,2°С (гексан-этилацетат).

Пример 9. N-[1-циано-2,3-секо-2-норлуп-20(29)-ен-3-аль-28-оил]-2(R,S)-аминобутан-1-ол (соединение IX) получали по методике, описанной в примере 7, используя (R,S)-(+/-)-2-аминобутан-1-ол. Выход 42%. R_f 0,35 (хлороформ-метанол 10:1). Т. пл. 166,2°С (гексан-этилацетат). (с 0,34, CHCl₃).

Пример 10. Исследование вирусингибирующей активности синтезированных соединений в отношении репродукции вируса герпеса простого I типа.

При проведении исследований использовали линию клеток рабдомиосаркомы человека (RD) и вирус герпеса простого I типа (ВГП-1, штамм 1 С). Монослойную культуру клеток RD, выращенную во флаконах, отмывали от ростовой среды, инфицировали 0,01-0,001 ТЦИД₅₀/клетка ВГП-1 путем нанесения разведений вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл и выдерживали в течение 1 ч при 37°С. Затем жидкость удаляли, клетки покрывали средой поддержки (среда DMEM), содержащей различные концентрации исследуемых соединений, которые предварительно растворяли в 10% этаноле. При последующем разведении использовали DMEM. Содержание этанола в конечных концентрациях соединений для исследования не превышало 1%. На каждую концентрацию изучаемого соединения использовали по 2-4 флакона с культурой клеток, инфицированной одним разведением вируса. Для изучения противовирусных свойств каждого соединения использовали 3-4 разведения вируса. После 48 ч инкубации при 37°С регистрировали морфологические изменения монослоя клеток (цитопатическое действие (ЦПД) вируса). На основе наличия/отсутствия ЦПД вируса во флаконах с разными концентрациями соединения вычисляли титр вируса. Первичным критерием противовирусного действия считали различия в сравнении с контролем вируса. На основе значений титра вируса вычисляли среднеэффективную концентрацию вирусингибирующего действия соединения (ЕС₅₀). Рассчитывали также отношение максимально переносимой концентрации (МПК) соединения к ЕС₅₀. МПК определяли как максимальную концентрацию соединения, не оказывающую влияния на морфологию неокрашенной культуры клеток за период инкубации (48 ч).

Полученные результаты приведены в таблице 2. Наиболее активны соединения I-IV, VI, VIII, IX.

Пример 11. Исследование вирулицидной активности синтезированных соединений в отношении вируса герпеса простого I типа.

Исследованию подвергали соединения, проявившие вирусингибирующие свойства в испытании, описанном в примере 10. При проведении исследований использовали линию клеток рабдомиосаркомы человека (RD) и вирус герпеса простого I типа (ВГП-1, штамм 1 С).

Вируссодержащую суспензию объединяли с равным объемом разведений исследуемых соединений на среде поддержки (среда DMEM). Смесь выдерживали при комнатной температуре в пределах заданного времени, после воздействия исследуемого соединения определяли инфекционный титр вируса (жизнеспособность остаточного вируса). Для этого готовили последовательные 10-кратные разведения смеси и вносили их в объеме 0,1 мл во флаконы с предварительно подготовленной монослойной культурой клеток RD. Флаконы помещали термостат, через 48 ч учитывали ЦПД вируса и вычисляли его титр. Снижение титра вируса под влиянием исследуемого соединения за время экспозиции определяли как разность между значениями в сравнении с точкой «0» (без экспозиции). На основании результатов, полученных при исследовании различных концентраций соединений, вычисляли ЕС₅₀ вирулицидного действия соединения. Среднеэффективное время (ЕТ₅₀) вирулицидного эффекта вычисляли из данных при различной экспозиции.

Полученные результаты приведены в таблице 3. Как видно, соединения II, III, VIII и IX обладали наиболее выраженной вирулицидной активностью в отношении вируса герпеса.

Пример 12. Исследование вирусингибирующей активности синтезированных соединений в отношении репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1).

При проведении исследований использовали перевиваемую суспензионную культуру Т-лимфобластоидной линии клеток человека МТ-4 и вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1, штамм ВИЧ-l_zmb). Для поддержки жизнедеятельности культуры клеток использовали среду RPMI-1640. Исследование выполняли в 96-луночных панелях, исследуемые соединения предварительно растворяли в 10% этаноле и затем разводили до получения необходимых концентраций средой поддержки. Инфицирование клеток МТ-4 проводили 10⁶ lg вируса. Инфицированную культуру клеток инкубировали в атмосфере 5% СО₂ при 37°С в течение 72 ч. После завершения инкубации учет результатов осуществляли посредством добавления в лунки панели реагента МТТ (3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид) в концентрации 7,5 мкг/мл. После выдерживания при 37°С в течение 3 ч надосадок из лунок удаляли, образовавшийся формазановый продукт растворяли в диметилсульфоксиде, затем проводили измерение интенсивности развившегося окрашивания на спектрофотометре при длине волны 550/630 нм. На основе полученных значений определяли процент жизнеспособных клеток, вычисляли ЕС₅₀ вирусингибирующего действия исследуемого вещества и соотношение МПК/ЕС₅₀, характеризующее широту спектра его нетоксических эффективных концентраций.

Вирусингибирующая активность у соединений I-IX не обнаружена.

Пример 13. Исследование вирулицидной активности синтезированных соединений в отношении вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1).

Исследования проводили в 96-луночных панелях с использованием перевиваемой суспензионной Т-лимфобластоидной линии клеток человека МТ-4 и поддерживающей среды RPMI-1640 в последовательности, изложенной в примере 11. После экспозиции вируссодержащей суспензии с разведениями исследуемого соединения готовили ряд серийных разведений этой смеси и инфицировали ими заранее подготовленную культуру клеток МТ-4. Определение процента жизнеспособных клеток проводили с помощью формазанового теста в МТТ-варианте, как описано в примере 12. Вычисляли ЕС₅₀ и ЕТ₅₀ вирулицидного действия исследуемого вещества.

Выраженную вирулицидную активность в отношении ВИЧ-1 проявили соединения VIII (ЕС₅₀=0,3 (0,5÷0,3) мкг/мл; ЕТ₅₀=0,9 (16,2÷0,05) мин) и IX (ЕС₅₀=0,6 (2,2÷0,2) мкг/мл; ЕТ₅₀=0,4 (15,9÷1,0) мин).

Полученные соединения перспективны для разработки противовирусных средств и могут быть использованы в качестве интермедиатов в синтезе новых биологически активных соединений.