Результат интеллектуальной деятельности: Штамм базидиального гриба Daedaleopsis confragosa, содержащий белки, проявляющие противоопухолевую и противовирусную активность

Изобретение относится к штамму базидиального гриба Daedaleopsis conf ragosa (де далеопсис шершавый), суммарные белки из мицелия которого проявляют противоопухолевую и противовирусную активность и может быть использован в биотехнологии и микробиологической промышленности для получения противоопухолевых и противовирусных препаратов.

Плодовые тела дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa вееровидные, сидячие широкие, утолщаются к центру. Верхняя поверхность радиально морщинистая или гладкая от светло-серого, древесинного цвета до рыжеватого, буроватого, охристо-коричневого с концентрическими зонами. При высушивании выцветает. Нижняя поверхность имеет крупные поры, которые в зрелости удлиняются и становятся лабиринтовидными (почти пластинчатыми), сначала бледного цвета - сероватые, кремовые, затем до коричневого (Фиг. 1, 2).

Большую группу биологически активных веществ, содержащихся в грибах, составляют полипептиды, в том числе обладающих антивирусной активностью. Так, Франк Пирано [Pirano F. F. The Development of the Antiviral Drug RC 28 from Rozites caperata (Pers.: Fr.) P. Karst. (Agaricomycetideae). International Journal of Medicinal Mushrooms. Vol. 7 (2005), P. 356] выделил из водного экстракта гриба Rozites coperata новое антивирусное лекарство белковой природы, препятствующее процессу репликации вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, цитомегаловирусов, респираторного синциального вируса и вируса гриппа типа А.

Антивирусный белок RC28 с антигерпетической активностью был очищен из PBS экстракта Rozites caperata (Cortinarious caperata), осажден ацетоном с последующей гельфильтрацией и ионообменной хроматографией. Молекулярную массу этого белка 28,251 кДа измеряли MALDI-TOF масс-спектрографии. Препарат RC28 подавляет репликацию ВПГ-1 in vitro (IC50)в концентрации 0,078 мг/мл и терапевтическим индексом >32. Полная пептидная цепь антивирусного белка RC28 из Rozites caperata имела 235 аминокислотных остатка и она не принадлежит ни одному из известных семейств белков [Gonga М., Pirainoc F., Yanb N., Zhanga J., Xiaa M., Mab J., Chenga J., Liub X. Purification, partial characterization and molecular cloning of the novel antiviral protein RC28 // Peptides. V. 30. - I. 4. - 2009. - P. 654-659].

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм Daedaleopsis confragosa 2266 который был выделен в чистую культуру в 2011 г. из спор плодовых тел, собранных в Горном Алтае. Штамм был передан в лабораторию микологии для исследований его противовирусной активности. Штамм хранится в Коллекции Ботанического института С.-Петербурга (LE-BIN). Водный экстракт из глубинного мицелия штамма Daedaleopsis confragosa 2266 проявил противовирусный эффект в отношении вируса гриппа разных субтипов [Теплякова Т.В., Псурцева Н.В., Косогова Т.А., Мазуркова Н.А., Власенко В.А. Противовирусная активность базидиальных грибов Горного Алтая // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии: Сборник научных статей по материалам IX Международной научно-практической конференции (25-27 октября 2010 г., Барнаул). - Барнаул: ARTHKA, 2010. - С. 245-246.; Teplyakova TV, Psurtseva NV, Kosogova ТА, Mazurkova NA, Khanin VA, Vlasenko VA. Antiviral activity of Polyporoid mushrooms (higher Basidiomycetes) from Altai Mountains (Russia). International Journal of Medicinal Mushrooms. 2012;14(1):37-45].

Водный экстракт из глубинного мицелия этог о же штамма проявил противоопухолевый эффект в отношении клеток карциномы гортани Нер-2 (концентрация сухих веществ экстракта, ингибирующая рост клеток на 50% (ИК50), составляла мкг/мл [Теплякова Т.В., Канаева О.И., Косогова Т.А., Костина Н.Е., Бардашева А.В., Трошкова Г.П. Отбор продуцентов противоопухолевых соединений среди базидиальных грибов // Наука и современность - 2011: сборник материалов XII Международной научно-практической конференции: в 3-х частях. Часть 1 / Под общ. ред. С.С. Чернова. - Новосибирск: Издательство НГТУ, 2011. - С. 217-223]. Белковые фракции, выделенные из глубинного мицелия Daedaleopsis confragosa 2266 показали противовирусный эффект в отношении вирусов простого герпеса 2 типа и иммунодефицита человека [Гилева И.П., Бардашева А.В., Гашникова Н.М., Балахнин С.М., Казачинская Е.И., Косогова Т.А., Теплякова Т.В. Противовирусные белки из базидиального гриба Daedaleopsis confragosa II Успехи медицинской микологии. - Т. 12. -М.: Национальная академия микологии, 2014. - С. 302-303].

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма базидиального гриба Daedaleopsis confragosa, продуцирующего белки, проявляющие более высокую (по сравнению с прототипом) активность в отношении клеток опухолей и некоторых вирусов, патогенных для человека.

Указанный технический результат достигается получением из природной среды нового штамма гриба Daedaleopsis confragosa К-1326 (авторское название), суммарные белки которого содержат соединения с противовирусной и противоопухолевой (цитостатической) активностью. Штамм Daedaleopsis confragosa К-1326 выделен из плодового тела трутовика дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa в окрестности р.п. Кольцове Новосибирской обл. в сентябре 2014 г. и депонирован в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером F-1368 (справка о депонировании прилагается).

Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлены плодовые тела Daedaleopsis confragosa на березе, а на фиг. 2 - то же, нижняя поверхность плодового тела. На фиг. 3 представлена колония штамма Daedaleopsis confragosa К-1326, а на фиг. 4 изображены гифы и одиночные пряжки штамма Daedaleopsis confragosa К-1326, ув. 400.

Культурально-морфологические особенности Daedaleopsis confragosa К-1326. В культуре образует плотные колонии сначала белого, затем с участками мицелия коричневого цвета. Мицелий слабо разветвленный, септированный, с многочисленными пряжками одиночного типа. Генеративные гифы бесцветные (фиг. 3, 4).

Биологическая активность определяется в отношении вирусов и опухолевых клеток. Для ее определения может быть использованы суммарные белки, выделенные из биомассы гриба, выращенной в глубинной культуре.

Активность определяется по способности в условиях in vitro тормозить рост опухолевых клеток или оказывать вирулицидный эффект (ингибировать процесс репликации вируса) в клеточных культурах (Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное сырье. - М.: Медицина, 1990. - II изд. - Вып. 2. - Т. 2. - С. 187-209; Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп.- М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 c.; Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США, под ред. З.П. Софьиной, А. Голдина. М.: Медицина, 1980. - С. 105-106).

Штамм хранится в виде культур, выращенных на скошенной агаризованной среде КГА (картофельно-глюкозный агар) в пробирках при температуре 2-6°С - 12 месяцев, а также в виде агаровых блоков в стерильной воде при 2-6°С - 12 месяцев.

Оптимальные среды для пересевов:

- жидкая на основе мелассы и кукурузного экстракта(МК), г/л: меласса -20, кукурузный экстракт -10, KH₂PO₄ - 3, MgSO₄×7 Н₂0 - 0,2 г/л;, вода водопроводная - до 1 л.

Штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов, перенесенных генов резистентности, генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик.

Штамм не токсичен, так как штаммы данного вида еще в СССР рассматривались как продуценты пищевого белка. Например, 1 кг белкового продукта из мицелия штамма Daedaleopsis confragosa Г-115 содержал белка столько же, сколько его содержит 1 кг мяса [И.А. Решетникова. Мицелий грибов как источник кормового и пищевого белка. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 55 с.].

Заявляемый штамм Daedaleopsis confragosa К-1326 отличается от прототипа более высокой скоростью роста на агаризованной среде. Ростовой коэффициент (РК) для штамма Daedaleopsis confragosa К-1326 при выращивании грибов на агаризованной картофельно-глюкозной среде (КГА) в поверхностной культуре составлял 66, а при глубинном культивировании на глюкозо-триптонной среде (ГТС), содержащей в 1 л воды: глюкозы - 35 г; триптона - 12 г; дрожжевого экстракта - 5 г, KH₂PO₄ - 1 г; MgSO4×7 H2O - 0,5 г, выход биомассы по сухим веществам составлял 11,0±0,5 г/л, в то время как для штамма Daedaleopsis confragosa 2266 ростовой коэффициент был 48, а выход сухой биомассы на ГТС составлял 10,5±0,7

[Бардашева А.В., Косогова Т.А., Теплякова Т.В. Отбор природных штаммов базидиальных грибов - продуцентов биологически активных субстанций по продуктивности биомассы // Современная микология в России. Том 5. Ред.: Ю.Т. Дьяков, Ю.В. Сергеев. Материалы III Международного микологического форума. Москва. 14-15 апр. 2015 г. М.: Нац. акад. микол. 2015. Том 5. С. 284-285]. Сухие вещества образцах определяли весовым методом по ГОСТ Р 52838-2007 «Корма. Методы определения содержания сухого вещества».

Преимуществом заявляемого штамма является способность суммарных белков ингибировать развитие патогенных вирусов и опухолевых клеток человека.

Пример 1. Выращивание биомассы гриба на основе заявляемого штамма Daedaleopsis confragosa К-1326 глубинным способом. Для получения биомассы в глубинных условиях готовилась питательная среда на основе мелассы и кукурузного экстракта (МК), г/л: меласса -20, кукурузный экстракт -10, KH₂PO₄ - 3, MgSO₄ - 0,2. Среду стерилизовали в автоклаве при 1,2 атм 30 мин. Погруженное культивирование осуществляли в 500 мл колбах с 100 мл среды на качалках. На первом этапе выращивали посевной материал. Для засева колб с посевной средой использовали культуру, выращенную при 28°С в течение 7 суток на овсяном агаре. Для ее приготовления 50 г зерен овса отваривали 1 час в 1 л воды, настаивали 12 ч, в полученный раствор добавляли агар-агар из расчета 20 г на 1 л. Среду автоклавировали при 1,2 атм 30 мин и разливали в чашках Петри, в течение 3 суток в 500 мл колбах с 75 мл питательной среды МК. Засев производили путем высечек стерильных блоков диаметром 5 мм, в каждый флакон помещали по 10 блоков. Рост посевной культуры продолжался 3 суток. Культивирование гриба для выделения белков из культуральной жидкости проводили на среде МК, засеянной посевной средой из расчета 10% к объему среды. Выращивание культуры проводили на круговой качалке (190 об/мин) при температуре 26-28°С в течение 10 суток.

Пример 2. Получение суммарных белков из культуральной жидкости Daedaleopsis confragosa К-1326. Жидкую культуру

Daedaleopsis confragosa К-1326 в объеме 800 мл фильтровали через стерильный марлевый фильтр (4-6 слоев марли), помещенный в воронку, в стеклянную колбу вместимостью 1 л. Края фильтра соединяли между собой и скручивали для наиболее полного извлечения жидкости. К полученному экстракту, при перемешивании, добавляли порциями сухой сульфат аммония до насыщения 70% (472 г/л). Полученную суспензию оставляли при 4-6°С на 16-18 ч для формирования осадка. Осадок собирали центрифугированием (7000 g - 15 мин) и растворяли в 15 мл воды.

Полученный биологический материал подвергали очистке при помощи гель-хроматографии на колонке (1,5×28 см, V=50 мл) с сефадексом G-25, собирая поглощающий при длине волны 280 нм вытекающий из колонки раствор фракциями по 3 мл. Анализ содержимого фракций проводили электрофорезом в 15%-ном ПААГ. Растворы фракций, содержащие белки, объединяли и подвергали диализу против 500 мл раствора, содержащего 20 мМ Трис-HC1, рН 7,5, 50 мМ NaCl.

Выход составлял 10-11 мл, суммарный белок 12-13 мг.

На электрофореграмме, при анализе раствора методом электрофореза в 15%-ном ПААГ, визуализировались мажорные полосы белков с молекулярными массами около 38000-40000 и 16000-18000 Да и минорные полоски с молекулярными массами 34000, 28000 и 26000 Да.

Препарат расфасовывали во флаконы по 0,5 или 1 мг и лиофильно высушивали в режиме: 4 ч - замораживание при минус 70-75°С; 16 ч - высушивание при 0,1 мм рт. ст.

Пример 3. Определение цитотоксической активности суммарных белков заявляемого штамма Daedaleopsis confragosa К-1326 в отношении клеток миеломы костного мозга человека (IM-9). Для изучения цитотоксической активности использовали МТТ-тест. Изучаемые соединения тестировали в трех параллельных измерениях при 6-и концентрациях - 10^-8, 10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4и 10^-3. Затем по кривой зависимости роста клеток от концентрации соединения определяли ИК₅₀, то есть концентрацию препарата, вызывающую торможение роста клеток на 50%. После определения ИК₅₀ проводили дополнительное тестирование при 4-5 концентрациях, близких к ИК₅₀.

Критерий оценки цитотоксического эффекта. Соединение считается цитотоксически активным при ИК₅₀≤10^-4, аналог известного противоопухолевого препарата оценивается как цитотоксичный, если его ИК₅₀≤ИК₅₀ препарата сравнения.

МТТ-тест основан на ферментном восстановлении неокрашенной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиозол-2-ил]-2,5-дифенилтетрозолия бромид, МТТ) в живых метаболически активных клетках с образованием голубых кристаллов формазана.

Постановка эксперимента. Культуру клеток миеломы костного мозга человека (IM-9) в концентрации 5×10³ в 100 мкл среды Игла MEM (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора), содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы (Gibco, США), помещали в 96-луночный планшет и инкубировали 24 ч при 37°С. Затем добавляли исследуемые соединения в различных концентрациях и инкубировали 48 ч при тех же условиях. После этого, в каждую лунку планшета добавляли по 5 мкл готового раствора МТТ (Sigma, США) (исходная концентрация 5 мг/мл) и дополнительно инкубировали 4 ч. По окончанию инкубации добавляли в каждую лунку планшета по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения образовавшихся в результате реакции синих кристаллов формазана и оценивали значения оптической плотности субстрата в лунках на микропланшетном ридере Tecan Sunrise (Тесап, Австрия) при длине волны 492 нм.

В качестве отрицательного контроля использовали клетки IM-9 без добавления исследуемого препарата. В качестве референс-препарата (положительный контроль) использовали противоопухолевый препарат Цисплатин (Лэнс-Фарм, Россия). Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1

Жизнеспособность культуры клеток миеломы костного мозга человека (IM-9) под влиянием суммарных белков дедалеопсиса шершавого (штамм Daedaleopsis confragosa К-1326)

Образец суммарных белков (штамм Daedaleopsis confragosa К-1326) показал цитотоксический эффект (таблица 1) в концентрациях 10^-3, сравнимый с положительным контролем (Цисплатином) в этой же концентрации (74,96 и 75,07% соответственно). Суммарный белок штамма-прототипа Daedaleopsis confragosa 2266 не подавлял, а стимулировал рост клеток миеломы костного мозга человека. Цисплатин в концентрации 10^-3 подавлял рост опухолевых клеток на 24,93%. Таким образом, можно сделать вывод, что образец суммарных белков дедалеопсиса шершавого (штамм Daedaleopsis confragosa К-1326) оказывал цитотоксическое действие на культуру клеток миеломы костного мозга человека (IM-9) в МТТ-тесте, сравнимое с противоопухолевым препаратом Цисплатином.

Пример 4. Определение цитотоксической активности заявляемого штамма Daedaleopsis confragosa К-1326 в отношении клеток лимфомы человека (Namalva). В соответствии с методикой, приведенной в примере 3, были проведены исследования на цитотоксичность суммарных белков штамма Daedaleopsis confragosa К-1326 в отношении лимфомы человека (Namalva). Результаты, свидетельствующие о цитостатической активности суммарных белков из глубинной культуры Daedaleopsis confragosa К-1326, представлены в таблице 2.

Таблица 2

Жизнеспособность культуры клеток лимфомы человека (Namalva) под влиянием суммарных белков дедалеопсиса шершавого (штамм Daedaleopsis Canfragosa К-1326)

Из таблицы 2 видно, что суммарный белок штамма Daedaleopsis confragosa 2266 не подавляет, а стимулирует рост клеток лимфомы человека, в то время как белок штамма Dae daleopsis с onfragosa К-1326 снижает жизнеспособность опухолевых клеток при концентрациях 0,001-0,0001 г/л на 27,1-33,66%.

Пример 5. Исследование токсичности и противовирусной активности суммарных белков Daedaleopsis confragosa К-1326 в отношении вируса простого герпеса второго типа (ВПГ-2). Оценку активности суммарных белков из глубинной культуры Daedaleopsis confragosa К-1326 в отношении вируса простого герпеса 2 типа проводили в культуре клеток Vero. В работе был использован штамм MS вируса простого герпеса 2 типа (получен из Американской коллекции типовых культур). Приготовленные разведения препаратов наносили на двухсуточную культуру (по 3 повторам на каждое разведение), за исключением контрольных лунок (контроль вируса и контроль клеток). Для оценки токсичности образцов клетки окрашивали раствором генциан-виолета. Результаты окрашивания регистрировали с помощью фотометра 680 Земфира с управляющим компьютером BioRed RU Zemf в соответствии с инструкцией производителя. Получали показатели оптической плотности (ОП) для каждой из лунок планшета при длине волны 570 нм. Вычисляли среднее значение ОП для каждой группы из трех лунок с различными концентрациями образца. По полученным значениям строили график зависимости ОП от концентрации образца. По графикам определяли 50% токсическую концентрацию (ТС₅₀).

Для определения противовирусной активности в лунки добавляли вирус в дозе 2×10^-5 БОЕ/клетку (объем рабочей смеси составлял 100 мкл). Учет реакции проводили на 4 сутки. Оценка активности проводилась при помощи метода ингибирования бляшкообразования. Клетки окрашивали генциан-виолетом. Процент ингибирования бляшкообразования (%ИБ) определяли по формуле: %ИБ=[1-(число бляшек в тесте / количество бляшек в контроле вируса)]×100. Определяли концентрацию, способную ингибировать развитие 50% бляшкообразующих единиц (БОЕ) от количества БОЕ в контроле (50% ингибирующую концентрацию - IC₅₀). Вычисляли среднее значение %ИБ для каждой группы из трех лунок с различными концентрациями образца. По полученным значениям строили график зависимости %ИБ от концентрации образца. По графикам определяли IC₅₀. Индекс селективности (IS) или терапевтический индекс (TI) определяли как отношение 50% токсической дозы к 50% ингибирующей дозы.

Препараты с TI>10 считали высокоактивными, а препараты с TI<2 не активными, препараты с TI между 2 и 10 считали средне активными (Paragas J. et al., 2004).Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3

Противовирусная активность суммарных белков разных штаммов Daedaleopsis confragosa в отношении вируса простого герпеса II типа, штамм MS.

Примечание: ТС₅₀-50% токсическая доза: доза препарата, подавляющая рост клеток на 50%.

IC₅₀ - ингибирующая доза: доза препарата, ингибирующая размножение вируса на 50%>.

IS - индекс селективности, или терапевтический индекс: равен отношению 50% токсической дозы препарата к 50%>ингибирующей дозе (TC₅₀/IC₅₀).

Как видно из таблицы 3, наибольшую противовирусную эффективность проявил штамм Daedaleopsis confragosa К-1326, как по ингибирующей эффективной дозе (IC₅₀=0,18 мкг/мл), так и по индексу селективности.

Пример 6. Исследование токсичности и противовирусной активности суммарных белков Daedaleopsis confragosa К-1326 отношении вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09) в культуре клеток MDCK (клетки почки собаки). Клетки MDCK рассевали в 96-луночных планшетах с посевной концентрацией 300000 кл/мл по 100 мкл в лунке. Разведения исследуемых образцов готовили в поддерживающей среде. В работе использовали последовательные двоичные разведения образцов. Приготовленные разведения препаратов наносили на суточную культуру (по 3 повтора на каждое разведение), за исключением контрольных лунок (контроль вируса и контроль клеток). Для определения противовирусной активности в лунки добавляли вирус в дозе 100 ТЦИД₅₀/лунку. Учет реакции проводили на 3 сутки. Оценка активности образцов была проведена с использованием красителя нейтрального красного. Результаты теста регистрировали с помощью фотометра 680 Земфира с управляющим компьютером BioRed RU Zemf в соответствии с инструкцией производителя. Получены показатели оптической плотности при длине волны 490 нм для каждой из лунок планшета. Для каждого разведения вычисляли среднее значение ОП. По полученным значениям строили графики зависимости ОП от концентрации препарата. По графикам определяли ТС₅о и 1С₅₀. Индекс селективности (IS) рассчитывали как отношение ТС₅₀ к IC₅₀ - Результаты представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, эффективная доза в отношении вируса гриппа у изученных штаммов IC₅₀ (мкг/мл) почти одинакова (0,2 и 0, 18.мкг/мл).

Таким образом, данные, приведенные в примерах 3-6 подтверждают заявляемый технический результат, заключающийся в том, что штамм гриба Daedaleopsis confragosa К-1326 продуцирует суммарные белки, выделяемые из глубинной культуры гриба, проявляющие ингибирующую активность в отношении клеток опухолей и некоторых вирусов, патогенных для человека.

Таблица 4

Противовирусная активность суммарных белков гриба штаммов Daedaleopsis confragosa в отношении вируса гриппа A/California/07/09(H1N1 pdm09)