Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА (НАД)

Изобретение относится к получению лекарственной субстанции - никотинамидадениндинуклеотида (НАД), соответствующего формуле

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) является одним из важнейших коферментов, ответственных за окислительно-восстановительные процессы в клетках. В настоящее время выявлена потенциальная роль НАД в терапии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Также препараты, содержащие НАД, используют в медицине при лечении заболеваний сердца, желудка и печени.

Известны методы получения НАД выделением продукта из культуральной жидкости, образующейся в процессе биосинтеза [CN 105481923, US 4515943, US 2016340378]. В способах по перечисленным патентам получение НАД из культуральной жидкости включает фильтрацию и/или ультрафильтрацию культуральной жидкости, очистку полученного раствора ионообменной хроматографией или на неионогенных сорбентах с получением малоконцентрированных растворов НАД, которые подвергаются затем концентрированию методом лиофилизации или обратного осмоса. Из полученных концентрированных растворов НАД выделяют введением в водный раствор смешивающегося с водой органического растворителя, например этилового спирта, ацетона.

Во всех известных способах для выделения НАД требуется концентрирование водных растворов НАД с низким содержанием целевого продукта (не более 3 г/л). Процесс концентрирования столь разбавленных растворов осложняется низкой термостабильностью НАД, в связи чем необходимо проведение малопроизводительного процесса лиофилизации с большим объемом раствора или обратного осмоса, сопровождающегося значительными потерями продукта.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ по US 3140281, в соответствии с которым НАД выделяют из культуральной жидкости фильтрацией на воронке Бюхнера в смеси с кизельгуром, предварительной очисткой на слабоосновном анионите в ацетатной форме, хроматографией на макропористом сульфокатионите с получением разбавленного водного раствора НАД. Полученный водный раствор НАД концентрируют путем отгонки воды под вакуумом. Выделение НАД из концентрата осуществляют введением в раствор этилового спирта сначала в два приема с отделением неактивного осадка при достижении концентрации спирта около 60%, затем при добавлении спирта к фильтрату до достижении концентрации этанола 90% выпадает осадок НАД. Образовавшийся аморфный осадок отфильтровывают, промывают этанолом, затем диэтиловым эфиром и сушат в вакууме. Получают НАД с чистотой около 80-90%.

Существенным недостатком способа по US 3140281 является низкий выход продукта на стадии концентрирования НАД методом отгонки воды под вакуумом. Крайне низкая термостабильность водных растворов НАД обусловливает деструкцию НАД в процессе упарки с образованием продуктов разложения. Экспериментальное воспроизведение этой стадии выявило, что даже при вакууме ниже 10 мм рт.ст. в упаренном растворе содержится не более 50% продукта, взятого на концентрирование.

Заявляемый способ направлен на повышение выхода выделяемого из культуральной жидкости НАД, снижение затрат органических растворителей и упрощение технологического процесса.

Поставленная задача решается получением никотинамидаденин динуклеотида из культуральной жидкости процесса биосинтеза фильтрацией культуральной жидкости, предварительной очисткой полученного раствора, его концентрированием и выделением целевого продукта из концентрированного раствора.

Отличительными признаками заявляемого способа являются:

Концентрирование НАД переводом раствора в твердую фазу при температуре (минус 5±1)°С, плавление образовавшейся твердой фазы при температуре 2±2°С и сбор концентрированных фракций, образующихся при плавлении твердой фазы.

Положительный результат в заявленном способе достигается за счет следующих выявленных в процессе разработки особенностей выделения НАД из культуральной жидкости:

• Перевод разбавленного раствора НАД в твердую фазу при температуре (минус 5±1)°С, который не сопровождается деструкцией НАД;

• Плавление твердой фазы при температуре 2±2°С происходит с селективным накоплением НАД в жидкой фазе без деструкции целевого продукта;

Пример

Культуральную жидкость объемом 6,0 л, содержащую 15 г НАД, подвергают центрифугированию на центрифуге. Фильтрат охлаждают и смешивают с 1 кг кизельгура.

Смесь фильтруют через воронку Бюхнера большого диаметра, промывают осадок водой. Получают объединенный фильтрат объемом около 8 л, представляющий собой желтый прозрачный раствор.

Полученный раствор пропускают через колонку, содержащую слабоосновной анионит в ацетатной форме. В процессе прохождения раствора на анионите сорбируется большая часть примесей состоящих из нуклеотидных веществ и пигментов. НАД практически не сорбируется на анионит и переходит в фильтрат. Первые порции фильтрата, не содержащие НАД, отделяются от основного фильтрата. Колонка промывается небольшим количеством воды для вытеснения НАД из анионита.

В результате предварительной очистки раствора НАД на анионите получают 8 л слабоокрашенного раствора, содержащего 13,5 г НАД (1,7 г/л).

Раствор переносят в полиэтиленовую емкость и выдерживают при температуре (минус 5±1)°С в течение 5 часов. Полученную твердую фазу (ледообразную массу) подвергают дроблению и переносят в вертикальную колонну диаметром 12 см и высотой 100 см, снабженную рубашкой для подачи рассола для поддержания температуры в реакционной массе на уровне 2±2°С.

Образующаяся в результате плавления жидкая фаза собирается фракциями по 500 мл. Первые 2 фракции объемом 1,0 л с концентрацией 8,5 г/л используются для дальнейшего концентрирования НАД методом лиофилизации. Последующие 3 фракции объемом 1,5 л, содержащие 4,2 г НАД (концентрация 2.8 г/л), возвращают в цикл для последующего концентрирования методом вымораживания. Выход продукта на этой стадии составляет 94%.

Фракция объемом 1,0 л с концентрацией 8,5 г/л передается на дальнейшее концентрирование методом лиофилизации с получением раствора НАД с концентрацией 25-30%. Полученный концентрат доводят с помощью азотной кислоты до рН 2-3 и в раствор вводят этанол до достижения концентрации по этанолу 55-60%. Выпавшие в осадок примеси, состоящие преимущественно из пептидных соединений, отделяют фильтрацией. К полученному раствору дополнительно вводят этанол до достижения концентрации по этанолу 85-90%. Образовавшийся осадок аморфного НАД отделяют центрифугированием, промывают этанолом, затем диэтиловым эфиром и сушат в вакууме. Получают 7,7 г аморфного порошка НАД с чистотой 85%.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает 8-кратное снижение объема раствора НАД, подвергаемого лиофилизации, что обеспечивает доступность способа для промышленного применения.

Полученный аморфный НАД может быть дополнительно очищен способом по DE 3141030 с получением кристаллического НАД с чистотой не менее 95%.