Результат интеллектуальной деятельности: КОНСТРУКЦИЯ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ КАРТРИДЖА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Изобретение относится к устройствам для лабораторного анализа в биологии и может быть использовано при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Описаны устройства для проведения ПЦР, в которых подготовка образца и реакционный модуль интегрированы в одноразовый картридж, который состоит из совокупности жидкостных камер, картриджа с реагентами и пневматически активируемого MOVe-клапана, а также модуля анализа (RU 2559541 С2, ИНТЕДЖЕНКС ИНК., 10.08.2015). Устройства для ПЦР функционируют при открытом перемещении жидкостей между ячейками картриджа. Например, реагент может находиться в ячейке, образец - в ячейке для сбора образцов, разбавитель - в ячейке для разбавителей и поверхность захвата может находиться в ячейке для анализа, причем в одном состоянии картриджа ни одна из ячеек не находится в жидкостном сообщении с любой из других ячеек (RU 2628051 С2, ТЕРАНОС ИНК. (US), 14.08.2017).

Описаны другие конструкции одноразовых картриджей для осуществления ПЦР (JP 2016192931 (А) - CARTRIDGE FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION REACTION, AND NUCLEIC ACID AMPLIFICATION APPARATUS, SEIKO EPSON CORP, 17.11.2016).

В заявке GB 2516672 (A) - System and method for processing fluid in a fluidic cartridge, ATLAS GENETICS LTD, 04.02.2015 отмечается, что недостаточное заполнение камеры ПЦР даже небольшим количеством может привести к образованию воздушных карманов в ПЦР-камере, что, в свою очередь, может привести к нестабильному результату термоциклирования. При этом даже незначительное переполнение камеры ПЦР приводит к необработанной жидкости после камеры ПЦР, которая затем может разбавлять образец обработанной текучей среды, когда она перемещается из камеры ПЦР в камеры анализа.

Проточный вариант ПЦР имеет ряд недостатков, а именно образование пузырьков воздуха в микроканалах рабочих зон картриджей, что неблагоприятно влияет на ход ПЦР (Г.Е. Рудницкая, А.А. Евстрапов. МИКРОЧИПОВЫЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ. Ч. 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПЦР; КОНСТРУКЦИЯ И МАТЕРИАЛЫ МИКРОЧИПОВ (Обзор). Ж. НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2008, том 18, No 3, с. 3-20). Описан ряд технических решений, касающихся формы рабочих зон картриджей. Так, в патенте RU 2497100 С2, КОНИНКЛЕЙКЕ ФИЛИПС ЭЛЕКТРОНИКС Н.В. (NL), 27.10.2013 описана рабочая зона для размещения жидкого образца в форме плоскодонного углубления, связанного каналами для заполнения этого углубления рабочей смесью.

Наиболее близким к патентуемому является картридж, описанный в патенте US 7327459 (В2), SAMSUNG ELECTRONICS СО LTD, 05.02.2008 - прототип, который предназначен для проведения флуоресцентного анализа ПЦР в реальном времени. Картридж включает верхнюю подложку 110, имеющую камеру 105, связанную каналами 103 с отверстиями для подачи 106 и выпуска 108 образца, и нижнюю подложку 112. Микронагреватель 102 прикреплен к нижней подложке 112 для регулирования температуры реакции. Подложки 110, 112 могут быть выполнены из силикона, металла или пластмасс, имеющих высокую теплопроводность с использованием фотолитографии, горячего тиснения или пластикового формования. Однако в этом устройстве не рассматриваются средства, обеспечивающие уменьшение влияния пузырьков воздуха, которые оказывают влияние на результаты ПЦР.

Настоящее изобретение направлено на решение проблемы усовершенствования рабочей зоны картриджа для проведения ПЦР.

Патентуемый картридж для проведения полимеразной цепной реакции включает пластину из оптически прозрачного материала, образованную в теле пластины рабочую зону, диаметрально расположенные каналы для заполнения реагентами рабочей зоны, подложку, расположенную в нижней части картриджа, выполненную с возможностью нагрева рабочей зоны.

Отличие состоит в следующем.

Рабочая зона имеет форму полого цилиндра с донной выпуклой частью, ограниченной плоским основанием, обращенным к подложке, выпуклая часть образована концентрическими выточками на боковой поверхности, причем диаметры выточек убывают от периферии к центру и лежат в диапазоне от 0,8 до 0,5 D, где D - диаметр цилиндра, а глубина вдоль продольной оси цилиндра между донной частью и плоским основанием составляет от 0,28 до 0,32 Н, при этом каналы для заполнения реагентами выполнены в виде канавок и сообщены с рабочей зоной так, что их донные части удалены от основания полого цилиндра на расстояние не менее 0,3Н, где Н - толщина пластины

Картридж может характеризоваться тем, что пластина имеет удлиненную форму с продольной осью симметрии и параллельными стенками в поперечном направлении, при этом рабочая зона размещена с одного края пластины на расстоянии 0,25-0,3 наибольшей длины пластины, канавки на плоскости пластины имеют несквозные отверстия для размещения силиконовых пробок, а в местах выхода канавок на торцевые поверхности пластины образованы полукруглые фаски.

Картридж может характеризоваться и тем, что пластина имеет длину 55 мм, ширину - 40 мм, толщину - 2 мм, диаметр рабочей зоны - 10 мм, а также и тем, что оптически прозрачный материал представляет собой полиметилметакрилат, а кроме того, тем, что подложка выполнена из алюминиевой фольги и герметично присоединена к поверхности пластины термосваркой или склеиванием.

Технический результат - исключение образования пузырьков воздуха в рабочей зоне картриджа как при заполнении рабочей смесью, так и в процессе термоциклирования за счет того, что рабочая смесь будет эффективно выталкивать пузырьки воздуха из рабочей зоны, а ступенчатая структура - увеличивать смачиваемость вследствие развитой поверхности рабочей зоны.

Существо изобретения поясняется на чертежах, где:

фиг. 1 - пластина со стороны рабочей зоны;

фиг. 2 - то же, что на фиг. 1, вид сбоку;

фиг. 3 - картридж, вид в изометрии;

фиг. 4 - конфигурация рабочей зоны, вид сверху;

фиг. 5 - рабочая зона, сечение;

фиг. 6 - картридж в рабочем состоянии.

Картридж для проведения полимеразной цепной реакции включает плоскую пластину 1 из оптически прозрачного материала, рабочую зону 2, образованную в теле пластины 1, каналы 3 для заполнения реагентами рабочей зоны 2. Подложка 4 выполнена из алюминиевой фольги и герметично присоединена к поверхности пластины термосваркой или склеиванием.

Рабочая зона 2 имеет форму полого цилиндра 21 диаметром D с выпуклой донной частью 22 в основании 23. Донная часть 22 образована концентрическими выточками 221, 222, 223 на боковой поверхности и ограничена плоским основанием 24. Диаметры выточек 221, 222, 223 убывают от периферии к центру и лежат в диапазоне от 0,8 D до 0,5 D; диаметр плоского основания 24 составляет 0,5 D.

Соответственно соотношение диаметров выточек удовлетворяет условию: D>D₂₂₁>D₂₂₂>D₂₂₃>D₂₄, где индексы при D соответствуют позициям выточек на фиг. 3-4.

Глубина вдоль продольной оси 210 цилиндра 21 между донной частью 22 и плоским основанием 24 составляет от 0,28 до 0,32 Н, где Н - толщина пластины 1.

Каналы 3 для заполнения реагентами размещены в диаметральной плоскости 210 полого цилиндра 21, выполнены в виде канавок 31 и сообщены с рабочей зоной 2 так, что их донные части 311 размещены ниже основания 23, т.е. ближе к тыльной стороне пластины на глубине h не менее 0,3Н.

Пластина 1 имеет удлиненную форму с продольной осью 11 симметрии и параллельными стенками 12 в поперечном направлении. Рабочая зона 2 размещена с одного края пластины 1 на расстоянии S=0,25-0,3 наибольшей длины пластины 1. Канавки 31 на плоскости пластины 1 имеют несквозные отверстия 32 диаметром около 3,5 мм для установки силиконовых пробок, предотвращающих вытекание жидкости из картриджа. В местах выхода канавок 31 на торцевые поверхности 13 параллельных стенок 12 образованы полукруглые фаски 14.

Пластина 1 в направлении оси 11 имеет длину L=55 мм, ширину W=40 мм, толщину Н=2 мм, диаметр рабочей зоны составляет D=10 мм и может быть выполнена из оптически прозрачного полиметилметакрилата.

На фиг. 6 схематично показан картридж в рабочем состоянии, где обозначены: ТЦ - поверхность термоциклера, PC - рабочая среда, В - направление подсветки для возбуждения флуресценции, Ф - анализируемый сигнал флуоресценции от рабочей среды.

Картридж заполняют через канавки 31 рабочей средой посредством шприцев, затем в отверстия 32 устанавливают силиконовые пробки. При этом пузырьки воздуха в процессе заполнения рабочей зоны будут удаляться из нее: рабочая смесь будет эффективно выталкивать пузырьки воздуха из рабочей зоны, а ступенчатая структура - увеличивать смачиваемость вследствие развитой поверхности рабочей зоны. Исключение пузырьков воздуха необходимо для исключения их влияния на обработку результата ПЦР, так как их хаотичное перемещение и объединение вносит помехи в сигнал, тем самым искажая сигнал, получаемый при детекции флуоресценции.

Затем картридж устанавливают в измерительное устройство так, чтобы подложка 4 находилась в тепловом контакте с поверхностью ТЦ. Возбуждение флуоресценции осуществляют подсветкой В с торцевых поверхностей 13 стенок 12, а анализируемый сигнал Ф флуоресценции от рабочей среды PC детектируют с тыльной стороны пластины 1.

Испытания показали, что технический результат в полном объеме достигается заявленной совокупностью признаков, а именно, в реакционной среде в рабочей зоне картриджа отсутствуют пузырьки воздуха. В то же время модельные эксперименты показали, что в отсутствие ступенчатой формы стенки и нерегламентированной высоты каналов в рабочей зоне образовывались пузыри воздуха, которые хаотично перемещались и укрупнялись, оказывая негативное влияние как на процесс термоциклирования, так и на детектирование флуоресценции во время проведения ПЦР.