×
16.06.2018
218.016.6211

Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках в программе экстракорпорального оплодотворения

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). На основании анализа уровня экспрессии мРНК гена PFKP в кумулюсных клетках определяют вероятность наличия анеуплоидий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества по формуле. При значениях р выше 0,5 прогнозируют наличие хромосомных аномалий в данной группе эмбрионов. Изобретение обеспечивает создание модели предсказания наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании анализа транскрипционной активности в кумулюсных клетках у пациенток при лечении бесплодия в программе ЭКО. 1 табл., 3 пр.

В последние годы в области методов лечения бесплодия были достигнуты большие успехи. Несмотря на постоянное совершенствование методик вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), эффективность одной попытки экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) не превышает 33%, а частота родов живым плодом - 24,8% [1]. Основным фактором, определяющим вероятность наступления клинической беременности и рождения живого здорового ребенка, является качество переносимых в полость матки эмбрионов [2].

В настоящее время выбор эмбрионов для переноса осуществляется, в основном, на основании морфологических критериев оценки качества. Несмотря на то, что в рутинной клинической практике морфологическая оценка качества эмбрионов является простым и неинванизивным методом, данный метод диагностики является субъективным и не позволяет оценить наличие хромосомных аномалий у переносимых эмбрионов, что, в свою очередь, снижает шансы наступления клинической беременности [3, 4, 5, 6].

На сегодняшний день стало возможным проведение предимплантационного генетического скрининга (ПГС) эмбрионов в циклах ЭКО. Данный метод позволяет диагностировать генетическую патологию эмбриона на этапе до переноса в полость матки [5]. И хотя перенос эуплоидного эмбриона не является 100% гарантией наступления клинической беременности, он существенно повышает ее шансы, вплоть до 70-75% [7].

Предимплантационный генетический скрининг в последние годы активно развивается, показания к его проведению постоянно расширяются, однако данное исследование является дорогостоящим, что приводит к ограничению его использования в широкой практике.

Таким образом, развитие точных малоинвазивных объективных методов оценки качества эмбрионов с высоким потенциалом к имплантации и отсутствием хромосомных аномалий является одним из наиболее важных направлений репродуктивной медицины [8].

Достаточно многообещающе выглядят исследования последнего десятилетия, показывающие возможность оценки качества ооцитов по состоянию окружающих его клеток, получаемых при выделении кумулюсооцитарного комплекса после пункции фолликула при лечении в программе ЭКО [9,10, 11].

Кумулюсные клетки находятся в непосредственной близости к ооциту и постоянно реагируют на изменения, происходящие в интра-фолликулярной среде, что обуславливает возможность получения информации о состоянии ооцита посредством обнаружения молекулярно-генетических изменений в кумулюсных клетках. Например, модели экспрессии определенных генов отражают процессы, происходящие в клетке в данный момент времени, в том числе и ответ клеток на различные воздействия окружающей среды. Таким образом, анализ экспрессии генов в кумулюсных клетках может выявить данные об условиях внутри фолликула и качестве полученных ооцитов, определяя их способность к дальнейшему созреванию, успешному оплодотворению и последующему эмбриональному развитию.

В связи с этим, нами было проведено ретроспективное исследование транскрипционной активности в кумулюсных клетках эмбрионов различного качества согласно морфологическим критериям оценки у пациенток, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО/ИКСИ с последующим проведением предимплантационного генетического скрининга. Данное исследование позволило охарактеризовать взаимосвязь уровня экспрессии мРНК изучаемых генов в кумулюсных клетках с наличием хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества.

Результат изобретения - создание модели предсказания наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании анализа транскрипционной активности в кумулюсных клетках у пациенток при лечении бесплодия в программе ЭКО.

После проведения трансвагинальной пункции под контролем стереомикроскопа Nikon клиническим эмбриологом осуществлялся просмотр аспирированной фолликулярной жидкости с целью идентификации ооциткумулюсных комплексов (ОКК). Стерильными иглами проводили отрезание клеток кумулюса от ОКК под контролем стереомикроскопа в культуральной чашке Петри с буферным раствором (COOК, Ирландия). Производили маркировку образцов кумулюсных клеток соответственно ооциту. Во избежание деградации РНК взятие материала (кумулюсные клетки) осуществляли в пробирки с раствором гуанидинтиоционата (лизирующий раствор наборы "Проба НК"), помещали в холодильную камеру на -20°С, а затем отдавали генетику на анализ.

На 5-е сутки культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы, материал отправляли в лабораторию молекулярно-генетических методов для анализа хромосомных нарушений методом сравнительной геномной гибридизации. После проведения биопсии все эмбрионы витрифицировались.

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) генетического материала эмбриона проводилась с использованием оборудования фирмы Agilent (США). Полногеномную амплификацию ДНК исследуемых клеток проводили с помощью набора для проведения WGA-PCR PicoPlex SingleCell WGA Kit (Rubicon Genomics,CШA) и набора для проведения MDA GenetiSure Pre-Screen Amplification and Labeling Kit (Agilent,CШA). Качество и количество полученной в ходе амплификации ДНК контролировали с помощью 1,2% агарозного электрофореза. Мечение ампликонов проводили с помощью набора SureTag DNA labeling Kit Agilent (США) согласно прилагаемой инструкции. Мечение ампликоны наносили на биочип Sure Print G3 8×60 aCGH Agilent (США), гибридизировали 16 часов, после чего проводили отмывку и сканирование на сканере биологических чипов SureScan Microarray Scanner. Интерпретацию полученных результатов проводили с помощью программного продукта Agilent CytoGenomics.

После получения результатов предимплантационного генетического скрининга проводился анализ транскрипционного профиля в кумулюсных клетках. Осаждение РНК проводили изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками промывочными растворами. В реакции обратной транскрипции использовали смесь специфических олигонуклеотидов всех исследуемых генов. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналу FAM на каждом цикле при температуре отжига праймеров. Реализация «горячего старта» обеспечивалась использованием Taq-полимеразы, активность которой блокировалась антителами и восстанавливалась при прогреве. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки. Уровень экспрессии измеряли в относительных единицах (о.е.) относительно референсных генов ТВР, В2М, GUSB методом сравнения пороговых циклов (ΔCq).

С помощью бинарной логистической регрессии возможно рассчитать вероятность наступления события (в данном случае наличие хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества) в зависимости от значений независимой переменной (уровня экспрессии мРНК гена PFKP).

Вероятность наступления события (вероятность наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества) (р) рассчитывается по формуле, имеющий общий вид:

p=exp(logit)/(1+exp(logit)

где р - искомая вероятность наступления события.

При значениях р менее 0,5 можно предположить, что измеряемое событие не наступит; в противном случае предполагается наступление события.

Согласно результатам логистической регрессии построено уравнение для предсказания вероятности наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества:

logit=-2,59+0,48*PFKP

где PFKP - уровень экспрессии мРНК гена PFKP.

Построенная модель является статистически значимой (χ2=6,99, р=0,008).

Средняя точность прогнозирования вероятности наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества составляет 84,3%, ОШ равно 29,3.

Таким образом, можно оценить вероятность наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества в программе ЭКО на основании оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках (уровня экспрессии мРНК гена PFKP).

Таблица 1.

Классификация предсказания наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества в программе ЭКО/ИКСИ

Пример

I. Прогнозирование наличия хромосомных аномалий в эмбрионах провели у пациентки М. 32 лет с трубным фактором бесплодия, обратившейся для проведения программы ЭКО/ИКСИ + ПГС. В анамнезе 3 беременности, две из которых - внематочные, в связи с чем в 2009 и 2011 гг пациентке были выполнены операции в объеме лапароскопии, левосторонней и правосторонней тубэктомии, соответственно. Третья беременность наступила в результате программы ЭКО и ПЭ, завершилась самопроизвольным выкидышем в сроке 8 недель. Кариотип абортуса - мозаичная форма трисомии по хромосоме 13. Данная попытка ЭКО вторая.

Отрезание клеток кумулюса от ОКК проводили после трансвагинальной пункции стерильными иглами под контролем стереомикроскопа в культуральной чашке Петри с буферным раствором.

На 5-е сутки культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы, материал отправляли в лабораторию молекулярно-генетических методов для анализа хромосомных нарушений методом сравнительной геномной гибридизации.

Анализ транскрипционного профиля в кумулюсных клетках проводился после получения результатов ПГС.

Результат проведенного исследования у пациентки М:

Уровень экспрессии мРНК гена PFKP - 8,77 о.е.

Вероятность (р) наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона рассчитывали по вышеописанной формуле:

logit=2,59-0,48* PFKP=2,59-0,48* 8,77=1,62

p=exp(logit)/(1+exp(logit)=0,15

Рассчитанная вероятность р указывает на низкую вероятность наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона.

Результат проведения предимплантационного генетического скрининга - N, XX (нормальный женский кариотип).

II. Прогнозирование наличия хромосомных аномалий в эмбрионах провели у пациентки Г. 37 лет с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, обратившейся для проведения программы ЭКО/ИКСИ + ПГС. В анамнезе 2 беременности, одна из которых завершилась самопроизвольным выкидышем на малом сроке, вторая - правосторонняя внематочная беременность, в связи с чем пациентке в 2012 году была проведена лапароскопия, правосторонняя тубэктомия. Показанием к проведению предимплантационного генетического скрининга послужил старший репродуктивный возраст супругов (Муж, 42 лет, спермограмма-нормозооспермия). Данная попытка ЭКО первая.

Отрезание клеток кумулюса от ОКК проводили после трансвагинальной пункции стерильными иглами под контролем стереомикроскопа в культуральной чашке Петри с буферным раствором.

На 5-е сутки культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы, материал отправляли в лабораторию молекулярно-генетических методов для анализа хромосомных нарушений методом сравнительной геномной гибридизации.

Анализ транскрипционного профиля в кумулюсных клетках проводился после получения результатов ПГС.

Результат проведенного исследования у пациентки Г:

Уровень экспрессии мРНК гена PFKP - 0,19 о.е.

Вероятность (р) наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона рассчитывали по вышеописанной формуле:

logit=2,59-0,48* PFKP=2,59-0,48* 0,19=2,5

p=exp(logit)/(1+exp(logit)=0,92

Рассчитанная вероятность р указывает на возможность того, что истинное значение результативного показателя попадет в расчетный прогнозируемый исход, в данном случае - на наличие анеуплоидий у исследуемого эмбриона.

Результат проведения предимплантационного генетического скрининга - гетероплоидный эмбрион.

III. Прогнозирование наличия хромосомных аномалий в эмбрионах провели у пациентки Ш. 25 лет с мужским фактором бесплодия, обратившейся для проведения программы ЭКО/ИКСИ + ПГС. Муж, 63 лет, спермограмма: олигоастенотератозооспермия. В анамнезе 3 неудачные попытки ЭКО. Беременности, гинекологические заболевания и оперативные вмешательства на органах малого таза отрицает. Показанием к проведению предимплантационного генетического скрининга послужили множественные неудачные попытки ЭКО в анамнезе и старший репродуктивный возраст супруга. Данная попытка ЭКО четвертая.

Отрезание клеток кумулюса от ОКК проводили после трансвагинальной пункции стерильными иглами под контролем стереомикроскопа в культуральной чашке Петри с буферным раствором.

На 5-е сутки культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы, материал отправляли в лабораторию молекулярно-генетических методов для анализа хромосомных нарушений методом сравнительной геномной гибридизации.

Анализ транскрипционного профиля в кумулюсных клетках проводился после получения результатов ПГС.

Результат проведенного исследования у пациентки Г:

Уровень экспрессии мРНК гена PFKP - 0,95 о.е.

Вероятность (р) наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона рассчитывали по вышеописанной формуле:

logit=2,59-0,48* PFKP=2,59-0,48* 0,95=2,13

p=exp(logit)/(1+exp(logit)=0,89.

Рассчитанная вероятность р указывает на высокую вероятность наличия хромосомных аномалий у исследуемого эмбриона.

Результат проведения предимплантационного генетического скрининга - -17, XX (анеуплоидный эмбрион).

Согласно полученным данным прогноз оценки вероятности наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества при проведении программ ЭКО/ИКСИ + ПГС носит достоверный характер. Следовательно, способ прогнозирования наличия анеуплоидий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества с использованием оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках может быть использован в клинико-лабораторной практике с целью минимизации экономических затрат в процессе лечения в программе ЭКО.

Список использованной литературы

1) Lifestyle factors and reproductive health: taking control of your fertility / R. Sharma [et al.] // Reprod Biol Endocrinol. - 2013. - Vol. 16, №11. - p. 66.

2) Краснощока, O.E. Возможности неинвазивной оценки состояния ооцита и эмбриона при проведении программ ВРТ по профилю экспрессии мРНК факторов роста в фолликулярной жидкости / О.Е. Краснощока, В.Ю. Смольникова, Е.А. Калинина // Журнал Акушерство и Гинекология. - 2014. - №9. - С. 36-43.

3) Correlation between aneuploidy, standard morphology evaluation and morphokinetic development in 1730 biopsied blastocysts: a consecutive case series study / M.G. Minasi [et al.] // Hum Reprod. - 2016. - Vol. 31, №10. - C. 2245-2254.

4) Morphokinetic analysis of cleavage stage embryos and its relationship to aneuploidy in a retrospective time-lapse imaging study / M. Chawla [et al.] // J Assist Reprod Genet. - 2015. - Vol. 32, №1. - C. 69-75.

5) ESHRE PGD consortium best practice guidelines for organization of a PGD centre for PGD/preimplantation genetic screening. / G. Harton [et al.] // Hum. Reprod. - 2011. - Vol. 26, №1. - P. 14-24.

6) Effect of infertility, maternal age, and number of previous miscarriages on the outcome of preimplantation genetic diagnosis for idiopathic recurrent pregnancy loss. / J.G. Garrisi [et al.] // Fertil. Steril. - 2009. - Vol. 92, №1. -P. 288-295.

7) Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: A randomized controlled trial / R.T. Scott [et al.] // Fertil. Steril. - 2013. - Vol. 100, №3. - P. 697-703.

8) Transcriptomic Analysis and Meta-Analysis of Human Granulosa and Cumulus Cells. / T. Burnik-Papler [et al.] // PLoS One. - 2015. - Vol. 10, №8. - P. e0136473.

9) Human cumulus cell gene expression as a biomarker of pregnancy outcome after single embryo transfer. / K.M. Gebhardt [et al.] // Fertil. Steril. - 2011. -Vol. 96, №l. - P. 47-52.

10) Specific gene expression differences in cumulus cells as potential biomarkers of pregnancy. / T. Burnik-Papler [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2015. - Vol. 30, №4. - P. 426-433.

11) Alteration of gene expression in human cumulus cells as a potential indicator of oocyte aneuploidy. / E. Fragouli [et al.] // Hum. Reprod. - 2012. - Vol. 27, №8. - P. 2559-2568.

Источник поступления информации: Роспатент

Showing 31-36 of 36 items.
28.06.2019
№219.017.9955

Способ метропластики у женщин с диффузно-узловой формой аденомиоза

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии. Выполняют лапароскопию с установкой двух рабочих троакаров в правой и левой подвздошных областях и одного центрального в параумбиликальной области. Выполняют ревизию брюшной полости, далее по выступающему контуру...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002692732
Дата охранного документа: 26.06.2019
16.08.2019
№219.017.c0a6

Методика проведения эхогистеросальпингографии с применением эхоконтрастного препарата соновью

Изобретение относится к акушерству и гинекологии, а именно к ультразвуковой диагностике в области акушерства и гинекологии, и может быть использовано для проведения эхогистеросальпингографии с применением эхоконтрастного препарата Соновью. Проводят обзорное трансвагинальное ультразвуковое...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002697370
Дата охранного документа: 13.08.2019
23.08.2019
№219.017.c2bf

Прогнозирование преэклампсии на основе определения внеклеточной днк плода в материнской крови при проведении скрининга первого триместра беременности

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования преэклампсии на основе определения внеклеточной ДНК плода в материнской крови при проведении скрининга первого триместра беременности. Для этого проводят забор материнской крови в 11-14...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002697845
Дата охранного документа: 21.08.2019
27.01.2020
№220.017.fa6d

Комбинированный способ лапароскопической гистеропексии и вагинопексии в сочетании с ректопексией, коррекцией высокого ректоцеле, энтероцеле

Изобретение относится к медицине, а именно к оперативной гинекологии и колопроктологии. Выполняют лапароскопию с установкой 2 латеральных троакаров на 5 см выше симфиза и на 8 см латеральней средней линии. По париетальной брюшине крестцово-маточных связок выполняют дугообразный разрез вершиной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002712006
Дата охранного документа: 23.01.2020
29.01.2020
№220.017.fb0f

Способ определения степени тяжести преэклампсии по относительному содержанию cd16+ моноцитов в периферической крови беременных

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и относится к способу определения степени тяжести преэклампсии по относительному содержанию CD16+ моноцитов в периферической крови беременных. Способ определения степени тяжести преэклампсии по относительному содержанию...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002712228
Дата охранного документа: 27.01.2020
17.06.2023
№223.018.7d9b

Способ брюшинного кольпопоэза при частичной облитерации дугласова пространства у пациентов с аплазией матки и влагалища

Изобретение относится к медицине, а именно к оперативной гинекологии. Осуществляют брюшинный кольпопоэз при частичной облитерации Дугласова пространства у пациенток с аплазией матки и влагалища. При этом в условиях дефицита брюшины Дугласова кармана на брюшину параректальной области с одной или...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002789199
Дата охранного документа: 31.01.2023
Showing 51-57 of 57 items.
29.05.2019
№219.017.6325

Количественная оценка hsa-mir-16-5p, hsa-mir-425-5p, hsa-mir-17-5p, hsa-mir-20a-5p, hsa-mir-101-3p, hsa-mir-30d-5p и hsa-mir-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкогинекологии, и предназначено для неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и высокой степени злокачественности цистаденокарцином яичников. Предложена количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002688169
Дата охранного документа: 20.05.2019
09.06.2019
№219.017.7cde

Способ лечения посттравматической энцефалопатии

Изобретение относится к медицине, а именно, к невропатологии, и касается лечения посттравматической энцефалопатии. Для этого внутривенно вводят эффективное количество ядросодержащих клеток пуповинной крови, полученных способом седиментации или градиентного центрифугирования образцов пуповинной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002413523
Дата охранного документа: 10.03.2011
09.06.2019
№219.017.7ce0

Способ лечения психических и неврологических расстройств

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и психиатрии, и касается использования стволовых клеток пуповинной крови для лечения психических и неврологических расстройств. Для этого вводят ядросодержащие клетки пуповинной крови, полученные способом седиментации или градиентного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002413524
Дата охранного документа: 10.03.2011
10.07.2019
№219.017.afae

Способ дифференциальной диагностики манифестной и асимптомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста

Способ предусматривает микроскопическое исследование биопроб из уретры, определяют количество лейкоцитов. Методом ПЦР в «реальном времени» определяют общее число геномов микроорганизмов, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты. Полученное значение величины общего числа геномов...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002458993
Дата охранного документа: 20.08.2012
17.07.2019
№219.017.b5d6

Клеточная линия hufshkkc6 - продуцент рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (фсг) и способ получения фсг с использованием данной линии

Изобретение относится к клеточным технологиям и может быть использовано для рекомбинантного получения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека. Клеточную линию huFSHKKc6 получают путем трансформации клеток huFSHIK экспрессионной плазмидой длиной 7719 п.о., состоящей из гена устойчивости...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002694598
Дата охранного документа: 16.07.2019
23.08.2019
№219.017.c2bf

Прогнозирование преэклампсии на основе определения внеклеточной днк плода в материнской крови при проведении скрининга первого триместра беременности

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования преэклампсии на основе определения внеклеточной ДНК плода в материнской крови при проведении скрининга первого триместра беременности. Для этого проводят забор материнской крови в 11-14...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002697845
Дата охранного документа: 21.08.2019
30.05.2023
№223.018.7422

Бесклеточные терапевтические средства для регенеративной медицины и способы их получения

Изобретение относится к медицине, а именно к терапевтическому средству для регенеративной медицины. Терапевтическое средство для регенеративной медицины, представляющее собой бесклеточную кондиционированную среду, содержащую продукты секреции мезенхимальных стромальных клеток (МСК) человека,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002742034
Дата охранного документа: 01.02.2021
+ добавить свой РИД