Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННО ОБУСЛОВЛЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У РАБОТНИКОВ, ЗАНЯТЫХ ВО ВРЕДНЫХ УСЛОВИЯХ ТРУДА

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицине труда, гигиене труда и может быть использовано для ранней диагностики производственно обусловленных заболеваний у работников, занятых во вредных условиях труда.

Обеспечение приоритета сохранения жизни и здоровья населения трудоспособного возраста, как основного гаранта социально - экономического развития страны, относится к одной из важнейших задач современной медицины.

Одним из эффективных путей снижения производственно-обусловленной заболеваемости в современных условиях является поиск ранних изменений в организме при воздействии неблагоприятных факторов [Клиническая лабораторная диагностика профессиональных заболеваний / под ред. А.И. Потапова. - Ярославль: Канцлер, 2013. - 312 с.].

Переход от состояния здоровья к болезни проходит ряд стадий, на которых организм пытается приспособиться к новым для него условиям существования путем изменения уровня функционирования и напряжения регуляторных механизмов. Прежде чем сформируется патологический процесс, нормальные адаптационные реакции уступают место механизмам компенсации, которые являются, по сути, маркерами предпатологии, затем наступает стадия обратимых изменений, и только после нее возникает повреждение структур [Юшков, Б.Г. Проблема нормы в физиологии и клинической медицине (дискуссионные вопросы) / Б.Г. Юшков, В.А. Черешнев // Лабораторная диагностика инфекционных и соматических заболеваний. - Екатеринбург: Граффика, 2015. - С. 166-180].

Основной задачей в этой связи является разработка и обоснование регламентированных этапов проведения профилактических мероприятий с целью предотвращения заболеваний в зависимости от формирования типа адаптационных реакций: нормальные адаптационные реакции, напряжение механизмов адаптации (кратковременная, или неустойчивая, адаптация), перенапряжение механизмов адаптации и их срыв ("полом").

Хроническое воздействие вредных производственных факторов связано с их взаимодействием со структурными компонентами клеток и вызывает цепь изменений в организме, которые могут приводить к развитию патологических процессов [Валеева Э.Т., Бакиров А.Б., Каримова Л.К. Профессиональные заболевания и интоксикации, развивающиеся у работников нефтехимических производств в современных условиях // Экология человека - 2010; 3: 19-23]. Изменение метаболических процессов предшествует развитию различных заболеваний, в том числе заболеваний, обусловленных профессиональными факторами [Измеров Н.Ф. Концепция долгосрочного социально-экономического развития Российской Федерации на период до 2020 г. («стратегия 2020») и сохранение здоровья работающего населения России. Медицина труда и промышленная экология. 2012; 3: 1-8].

В связи с этим, весьма актуальным является определение состояния адаптации у работников за счет выбора лабораторных маркеров и критериев их изменений, позволяющих дифференцировать группы низкого, среднего и высокого риска развития заболеваний, связанных с условиями труда.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования высокого риска развития производственно обусловленных и профессиональных заболеваний у работников химического комплекса, занятых во вредных условиях труда, включающий определение в сыворотке крови общего антиоксидантного статуса и количественного содержания продуктов перекисного окисления липидов и при одновременном увеличении количественного содержания перекисей в липидах более 4,31 мкмоль/л и снижении общего антиоксидантного статуса менее 1,3 ммоль/л прогнозируют высокий риск развития производственно обусловленных и профессиональных заболеваний [патент RU 2545911, 2015 г.]. Недостатком способа является использование только 2-х биохимических показателей, не позволяющих объективно оценить статус организма, а также использование абсолютных реферативных значений не позволяет дать индивидуальные прогнозы для каждого человека.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего с высокой достоверностью на стадии преморбидных изменений проводить оценку риска развития производственно обусловленных заболеваний на основании данных, полученных в результате стандартного обследования.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности прогноза за счет получения критериев для выделения групп низкого, среднего и высокого риска развития производственно обусловленных заболеваний, упрощение способа.

Предлагаемый способ прогноза осуществляется следующим образом: у работников в сыворотке крови определяют количественное содержание продуктов перекисного окисления липидов, показатели антиоксидантной активности: активность каталазы, массовую концентрацию витаминов Е и А.

Далее проводят ранжирование отклонений от нормы каждого показателя у обследуемого в баллах: значение показателя в норме оценивают как 0 баллов; отклонение показателя от нормы не более чем на 10% оценивают как 1 балл; отклонение показателя от нормы на 11-24% оценивают как 2 балла; отклонение показателя от нормы на 25-49% оценивают как 3 балла; отклонение показателя от нормы на 50-74% оценивают как 4 балла; отклонение показателя от нормы на 75% и более оценивают как 5 баллов. Производят суммирование баллов с целью определения группы низкого, среднего и высокого риска. При сумме полученных значений не более 8 баллов прогнозируют низкую степень риска развития профессионально обусловленных заболеваний, 9-15 баллов - среднюю степень риска, 16 и более баллов - высокую степень риска.

Интегрированный показатель риска (Р) у конкретного лица рассчитывается индивидуально с учетом наличия градаций по каждому биохимическому показателю путем суммирования баллов и соотнесения полученного значения со шкалой риска: Р = Σ баллов. Шкала риска рассчитана на основании определения диапазонов риска, зависящих от величины отклонения (в %) от среднего уровня референтных значений изученных биохимических показателей.

Граница минимального риска равна сумме значений баллов для всех градаций факторов P_min = Σ баллов, соответствующих R_min равняется от 0 до 8 баллов.

Граница среднего риска равна сумме значений баллов для всех градаций факторов P_med = Σ баллов, соответствующих R_med R_min равняется от 9 до 12 баллов.

Граница максимального риска равна сумме максимальных значений баллов для всех градаций факторов Р_mах = Σ баллов, соответствующих R_max равняется от 13 до 20 баллов.

Использование предлагаемого способа позволило выявить среди обследуемых лиц группу здоровых или низкого риска развития производственно обусловленных заболеваний, не имеющих на момент обследования существенных биохимических отклонений, у которых при углубленном обследовании скрытой патологии не выявлено; группу с неустойчивыми отклонениями исследованных параметров, у которых были обнаружены изменения не менее 2-х показателей, что позволяет выделить ее как группу среднего риска развития патологии от воздействия факторов производственной среды; и группу с устойчивыми и значительно выраженными изменениями не менее 3-4-х показателей с подозрением на хроническую профессиональную интоксикацию или группу высокого риска.

Определение продуктов перекисного окисления липидов в сыворотки крови

Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления определяют количественное содержание продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови. Кровь из вены в количестве 5 мл отбирают в пробирку. По истечении 20 минут кровь центрифугируют при 1500 оборотов в минуту в течение 15 мин при +4°С для отделения сыворотки крови, которую сразу подвергают анализу.

Описание метода.

Реактивы и их приготовление. 1. Серная кислота, 0,1 N. 2. Фосфор-новольфрамовая кислота (ФВК), 10%. 3. Тиобарбитуровая кислота (ТБК) - 0,67%. Готовят перед применением при нагревании и смешивают с ледяной уксусной кислотой (1:1). 4. Н-бутанол (хч).

Проведение реакции:

1. К 0,25 мл сыворотки крови добавляют 5 мл 0,1 N серной кислоты, 0,5 мл 10% раствора ФВК, перемешивают, выдерживают 5 минут при комнатной температуре, потом центрифугируют при 1500 оборотах в минуту в течение 5 минут. Одновременно с опытными образцами ставят холостую пробу (без сыворотки крови).

2. Супернатант сливают, к осадку приливают 4 мл дистиллированной воды, добавляют 1,0 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, перемешивают, инкубируют на водяной бане в течение 60 мин при 95°С.

3. По истечению времени пробы охлаждают, к пробе добавляют 4 мл н-бутанола и экстрагируют в течение 1 мин на вортексе. Для разделения слоев пробы центрифугируют в течение 5 мин в пробирках с пробками при 1500 оборотах в минуту.

4. Сразу после центрифугирования отбирают 3 мл супернатанта и измеряют оптическую плотность опытной пробы против холостой пробы при двух длинах волн 535 и 570 нм в кювете с толщиной слоя 1 см

5. Расчет содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови проводят по формуле:

С=(D535-D570 / 0.156) × 16,

где С - содержание продуктов перекисного окисления липидов в опытной пробе, мкмоль/л;

D535 - оптическая плотность опытной пробы при 535 нм;

D570 - оптическая плотность опытной пробы при 570 нм;

0.156 - коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый диальдегид - ТБК в л/мкмоль/ см;

16 - коэффициент разведения сыворотки.

Референтные значения 1,43-4,31 мкмоль/л.

Определение активности каталазы крови

Определение активности каталазы крови проводят спектрофотомет-рическим методом в сыворотке крови. Кровь из вены в количестве 5 мл отбирают в пробирку. По истечении 20 минут кровь центрифугируют при 1500 оборотов в минуту в течение 15 мин при +4°С для отделения сыворотки крови, которую сразу подвергают анализу.

Описание метода.

Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдата аммония или натрия соединение желтого цвета.

Реактивы и их приготовление.

1. 4% раствор молибдата аммония или натрия (4 г реактива растворяют в 100 мл воды).

2. 0,03% раствор перекиси водорода (готовят непосредственно перед использованием.

Проведение реакции:

Проба:

К 0,1 мл сыворотки, добавляют 2 мл перекиси водорода 0,03%, инкубируют 10 мин при комнатной температуре. После инкубации останавливают реакцию добавлением 1 мл молибдата аммония. Центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Измеряют оптическую плотность образцов при длине волны 410 нм против воды дистиллированной.

Параллельно с образцами ставят контроли - каждому образцу свой контроль.

Контроль:

К 0,1 мл сыворотки добавляют 1 мл молибдата, инкубируют 10 мин при комнатной температуре. По истечении времени инкубации добавляют 2 мл перекиси водорода. Центрифугируют 15 мин при 3000 оборотов. Измеряют оптическую плотность образцов при длине волны 410 нм против воды дистиллированной.

Холостая проба - вода.

Расчет активности каталазы

Активность каталазы определяют по формуле:

А=(Ек-En) × 75

где А - активность фермента, мКат/л

Ек - оптическая плотность контроля

En - оптическая плотность пробы.

Референтные значения: 10,6-23,0 мкат/л.

Определение массовой концентрации витамина А в сыворотке крови

Описание метода.

Определение массовой концентрации витамина А в сыворотке крови проводят в соответствии с методическими указаниями по измерению массовой концентрации витамина А в сыворотке крови на анализаторе биожидкости флуоресцентно-фотометрический «Флюорат-02-АБЛФ. Методика М 07-01-2001, утвержденная директором НПФ «ЛЮМЭКС» 15.02.2001. Метод основан на определении флуоресценции ретинола в гексановом экстракте сыворотки, предварительно подвергнутой воздействию воды и этанола.

Реактивы и их приготовление.

1) раствор аскорбиновой кислоты массовой доли 10%. 10 г аскорбиновой кислоты растворяем в 90 см³ дистиллированной воды;

2) раствор гидроокиси калия в этаноле массовой доли 10%. 10 г гидроокиси калия растворяем в 90 см³ этилового спирта;

3) приготовление растворов ретинолацетата;

а) приготовление исходного раствора ретинолацетата

1 см³ стандартного образца состава раствора ретинолацетата переносят в мерную колбу вместимостью 25 см³ и доводят до метки гексаном. Концентрацию ретинолацетата в данном растворе рассчитывают по формуле:

где Ссо - концентрация стандартного образца состава раствора ретинолацетата, указанная в свидетельстве на СО, мг/см³;

1 - объем СО, взятый для разбавления, см³;

25 - объем приготовленного раствора, см³;

б) приготовление рабочего раствора ретинолацетата

Рабочий раствор ретинолацетата массовой концентрации 100 мкг/см³ готовят из исходного путем разбавления его этанолом.

Проведение реакции:

1. Гидролиз ретинолацетата

Проводят гидролиз 5 см³ рабочего раствора ретинолацетата и рассчитывают концентрацию раствора по следующей формуле:

где Ск - концентрация витамина А (гидролизованной формы) в колбе, мкг/см³;

Сраб - концентрация исходного рабочего раствора ацетатной формы витамина А, мкг/см³;

Vpaб - объем рабочего раствора витамина, взятого для гидролиза;

Vк - объем колбы, в которую переведен экстракт после гидролиза (25 см³);

К - коэффициент пересчета для перевода исходной формы ретинолацетата в гидролизованную форму ретинола (0,87).

2. Приготовление градуированных растворов

Из полученного раствора ретинолацетата известной концентрации, рассчитанной по формуле (2), готовят последовательным разбавлением гексаном градуировочный раствор концентрации 1 мкг/см³.

3. Подготовка пробы

В две центрифужные пробирки помещают по 1 см³ дистиллированной воды и 1 см³ этанола, затем в одну из них помещают 1 см³ дистиллированной воды (образец N 1), во вторую - 1 см³ сыворотки крови (образец N 2). Пробирки встряхивают в аппарате типа «Vortex» 30 секунд. После встряхивания добавляют 5 см³ гексана и встряхивают в аппарате типа «Vortex» 1 мин. После встряхивания пробы центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Четко отделившийся гексановый слой используют для проведения определения.

4. Измерение массовой концентрации витамина А в экстракте

1) Подготовка анализатора к работе

Выбирают в режиме «Рабочий текст» название методики «Вит А» и нажимают клавишу «Ent». В главном меню анализатора выбирают режим работы «Ввод программы» и вводят запрашиваемые данные согласно методике. В качестве светофильтров при измерении витамина А применяют светофильтр возбуждения А-1 (335 нм) и светофильтр А-2 (460 нм).

2) Проведение измерений массовой концентрации витамина А в экстракте

Для выполнения анализа Витамина А переходят в режим «Измерение» в главном меню анализатора и выполняют действия по запросам анализатора.

5. Обработка результатов измерений

Массовую концентрацию витамина А (X, мкг/см³) в сыворотке вычисляют по формуле:

где Сизм - концентрация витамина А

Vc - объем сыворотки, отобранный для анализа, см³;

Q - коэффициент, учитывающий разбавление экстракта.

Коэффициент разбавления равен

где Vk - объем разбавленного экстракта, см³;

Vpaзб - объем исходного экстракта, взятый для разбавления, см³.

Референтные значения: 30-80 мкг/дл.

Определение массовой концентрации витамина Е в сыворотке крови

Описание метода.

Определение массовой концентрации витамина Е в сыворотке крови проводят в соответствии с методическими указаниями по измерению массовой концентрации витамина Е в сыворотке крови на анализаторе биожидкости флуоресцентно-фотометрический «Флюорат-02-АБЛФ. Методика М 07-02-2001, утвержденная директором НПФ «ЛЮМЭКС» 27.03.2001. Метод основан на определении флуоресценции α-токоферола в гексановом экстракте сыворотки, предварительно подвергнутой воздействию воды и этанола.

Реактивы и их приготовление.

1) раствор аскорбиновой кислоты массовой доли 10%.

2) раствор гидроокиси калия в этаноле массовой доли 10%. 10 г гидроокиси калия растворяют в 90 см³ этилового спирта.

3) приготовление растворов α-токоферолацетата,

а) приготовление исходного раствора α-токоферолацетата: 5 см³ стандартного образца состава раствора α-токоферолацетата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки гексаном. Концентрацию а-токоферолацетата в данном растворе рассчитывают по формуле:

где Ссо - концентрация стандартного образца состава раствора ретинолацетата, указанная в свидетельстве на СО, мг/см³;

5 - объем СО, взятый для разбавления, см³;

100 - объем приготовленного раствора, см³;

б) приготовление рабочего раствора α-токоферолацетата. Рабочий раствор α-токоферолацетата массовой концентрации 100 мкг/см³ готовят из исходного путем разбавления его этанолом. Срок хранения раствора - 1 месяц при температуре 4-6°С.

Проведение реакции:

1. Гидролиз α-токоферолацетата

Проводят гидролиз 5 см³ рабочего раствора α-токоферолацетата согласно методическим рекомендациям и рассчитывают концентрацию раствора по следующей формуле:

где Ск - концентрация витамина Е (гидролизованной формы) в колбе, мкг/см³;

Сраб - концентрация исходного рабочего раствора ацетатной формы витамина Е, мкг/см³;

Vpaб - объем рабочего раствора витамина, взятого для гидролиза;

Vк - объем колбы, в которую переведен экстракт после гидролиза (25 см³);

К - коэффициент пересчета для перевода исходной формы α-токоферолацетата в гидролизованную форму α-токоферола (0,91).

2. Приготовление градуировочных растворов

Из полученного раствора α-токоферола известной концентрации, рассчитанной по формуле (2), готовят последовательным разбавлением гексаном градуировочные растворы концентрации 5, 10 и 15 мкг/см³.

3. Подготовка пробы

В две центрифужные пробирки помещают по 1 см³ дистиллированной воды и 1 см³ этанола, затем в одну из них помещают 1 см³ дистиллированной воды (образец N 1), во вторую - 1 см³ сыворотки крови (образец N 2). Пробирки встряхивают в аппарате типа «Vortex» 30 секунд. После встряхивания добавляют 5 см³ гексана и встряхивают в аппарате типа «Vortex» 1 мин. После встряхивания пробы центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Четко отделившийся гексановый слой используют для проведения определения.

4. Измерение массовой концентрации витамина Е в экстракте

1) Подготовка анализатора к работе

Выбирают в режиме «Рабочий текст» название методики «Вит Е» и нажимают клавишу «Ent». В главном меню анализатора выбирают режим работы «Ввод программы» и вводят запрашиваемые данные согласно методике. В качестве светофильтров при измерении витамина Е применяют светофильтр возбуждения Е-1 (292 нм) и светофильтр Е-2 (320 нм).

2) Проведение измерений массовой концентрации витамина Е в экстракте

Для выполнения анализа Витамина Е переходят в режим «Измерение» в главном меню анализатора и выполняют необходимые действия по запросам анализатора.

5. Обработка результатов измерений

Массовую концентрацию витамина Е (X, мкг/см³) в сыворотке вычисляют по формуле:

где Сизм - концентрация витамина Е в экстракте, мкг/см³;

Vэ - объем экстракта, см³;

Vc - объем сыворотки, отобранный для анализа, см³;

Q - коэффициент, учитывающий разбавление экстракта.

Коэффициент разбавления равен

где Vk - объем разбавленного экстакта, см³;

Vpaзб - объем исходного экстракта, взятый для разбавления, см³.

Референтные значения: 700-1200 мкг/дл.

С целью изучении возможности и достоверности применения предлагаемого способа прогнозирования проведено клиническое обследование пациентов Центра профессиональной патологии и клиники ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» и рассчитан риск развития производственно обусловленных заболеваний у работников химического комплекса, занятых во вредных условиях труда (75 человек). Повторное обследование позволило установить, что в процессе дальнейшего контакта с фактором производства среди работников, отнесенных к группе низкого риска клинические симптомы проявились у 3 человек (7,8±4,3% случаев); в группе среднего риска - у 5 человек (20,0±8,0% случаев); в группе высокого риска - у 7 человек (58,3±14,2% случаев) (р<0,001) (таблица).

В доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен тождественный способ определения риска развития производственно обусловленных заболеваний у работников, что позволяет сделать вывод о новизне предлагаемого технического решения.

Исследованиями авторов впервые было установлено и доказано, что предлагаемый способ раскрывает достоверные критерии оценки риска развития производственно обусловленных заболеваний у работников. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами клинического использования.

Пример 1. Работник А., стаж работы во вредных условиях труда 18 лет, возраст - 33 года. Активность каталазы в сыворотке 12,1 мкат/л - 1 балл, уровень витамина А 60,2 мкг/дл - 1 балл, уровень витамина Е 930 мкг/дл - 1 балл, уровень ПОЛ 3,2 мкмоль/л - 1 балл. Интегрированный показатель риска Р = 4, что соответствует минимальному риску, определяет работника в группу «практически здоров». Углубленное обследование работника и наблюдение за ним в течение 5 лет скрытой патологии не выявило.

Пример 2. Работник Б., стаж работы во вредных условиях труда 14 лет, возраст - 53 года. Активность каталазы в сыворотке 17,8 мкат/л - 1 балл, уровень витамина А 42,3 мкг/дл - 3 балла, уровень витамина Е 620,0 мкг/дл - 4 балла, уровень ПОЛ 4,2 мкмоль/л - 3 балла. Интегрированный показатель риска Р = 10, что соответствует среднему уровню риска, что требует углубленного обследования работника и динамическое наблюдение в условиях стационара с целью ранней диагностики патологии от воздействия факторов производственной среды.

Пример 3. Работник В., стаж работы во вредных условиях труда 33 года, возраст - 52 года. Активность каталазы в сыворотке 12,1 мкат/л 24,2 - 4 балла, уровень витамина А 9,6 мкг/дл - 5 баллов, уровень витамина Е 152,6 мкг/дл - 5 баллов, уровень ПОЛ 8,7 мкмоль/л - 4 балла. Интегрированный показатель риска Р = 18, что соответствует максимальному риску и определяет работника в группу с устойчивыми и значительно выраженными изменениями с подозрением на хроническую профессиональную интоксикацию. Данному работнику необходимо углубленное обследование и лечение в условиях стационара. Углубленное обследование работника и наблюдение за ним в течение 5 лет выявило гипертоническую болезнь и атеросклероз аорты.

Предлагаемый способ воспроизводим в условиях лаборатории и при его использовании достигается указанный технический результат. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Различия статистически достоверны относительно низкой степени риска:

* - p<0,05; ** - р<0,01.