Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium с повышенным содержанием фукоксантина

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium с высоким содержанием каротиноидного пигмента фукоксантина.

Пигмент фукоксантин, принадлежащий к группе кислородсодержащих каротиноидов ксантофиллов, был экстрагирован из следующих диатомовых водорослей: Chaetoseros sp. (Lio et al., 2011 a, b), Cylindrotheca closterium (Rijstenbil et al., 2003), Odontella aurita (Moreau et al., 2006) и Phaeodactylum tricornutum (Nomura et al., 1997).

Микроводоросль С. closterium является ценным сырьем для получения биологически активных веществ. Она содержит в достаточном количестве полиненасыщенные жирные кислоты и каротиноиды, что предполагает возможность ее массового культивирования. Содержание фукоксантина в клетках составляет 78% от общего количества каротиноидов (Das et al., 2008; Peng et al., 2011).

В недавних исследованиях, в основном японских ученых, показано, что фукоксантин обладает следующими свойствами: снижает избыточный вес, уменьшает уровень глюкозы в крови. Особо следует отметить противоопухолевое действие фукоксантина на клетки лейкоза человека, рака простаты и молочной железы, при низкой токсичности самого препарата (Das et al., 2008; Peng et al., 2011).

Содержание пигмента фукоксантина в диатомовой водоросли С. closterium варьирует в широких пределах в зависимости от условий культивирования. Известно, что содержание фукоксантина увеличивается и достигает максимальной величины при переходе диатомовых водорослей в стационарную фазу роста (Moreau et al., 2006). В стационарной фазе роста на фукоксантин приходится более половины всех каротиноидов. Содержание фукоксантина в диатомовых водорослях в стационарной фазе развития значительно выше, чем в экспоненциальной фазе роста по двум причинам: за счет уменьшения концентрации биогенных элементов (азота и фосфора) в среде и уменьшения освещенности в процессе увеличения концентрации клеток (Moreau et al., 2006). В этом случае увеличивается концентрация светособирающих пигментов.

При низкой освещенности наблюдается повышение концентрации фукоксантина, что вызвано эффектом антиокислительной защиты. При слабом освещении наблюдается низкий уровень синтеза активных кислородных комплексов, и, таким образом, слабое действие антиокислительных защитных ферментов (Rijstenbil, 2003).

Известен способ выращивания С. closterium, при котором выход фукоксантина на стационарной фазе роста составлял 1,06±0,06 мг пигмента⋅см^-3 объема клеток культуры. Культуру микроводоросли по этому способу выращивали на среде F/2 в трубчатых фотобиореакторах объемом 2 л, при температуре 15°С, низком освещении 27 μmol⋅m^-2⋅s^-1 и солености 35‰ (Rijstenbil, 2003).

По данным французских исследователей (Pasqueta et al., 2011) при выращивании С. closterium на среде F/2 при рН=7,6 в трубчатых фотобиореакторах объемом 2,2 л, при температуре 21°С и освещении 120 μmol⋅m^-2⋅s^-1 максимальное содержание фукоксантина составляло 5,34±0,06 мг⋅г^-1_сух. Экстракцию фукоксантина проводили из леофилизированной биомассы.

В основу изобретения «Способ получения биомассы диатомовой водоросли С. closterium с повышенным содержанием фукоксантина» поставлена задача увеличения выхода фукоксантина, содержащегося в биомассе диатомовой водоросли путем создания оптимальных условий культивирования С. closterium.

Технический результат: увеличивается содержание фукоксантина в биомассе диатомовой водоросли С. Closterium. Технический результат достигается за счет того, что культура микроводоросли С. closterium выращивается в режиме накопительного культивирования в плоских культиваторах с освещаемой поверхностью 0,0425 м² и толщиной освещаемого слоя 5 см при круглосуточном освещении 13,5 клк и температуре 20-22°C на модифицированной питательной среде (табл. 1), приготовленной на основе стерилизованной морской воды. Объем культуры составлял 2,35 л. В процессе выращивания культура непрерывно насыщается воздухом с помощью микрокомпрессора со скорость 0,5 л⋅мин^-1.

При данных условиях культивирования в конце стационарной фазы роста выход фукоксантина составляет 14,71 мг на 1 г сухой массы или с литра культуры выход фукоксантина составляет 38,76 мг⋅л^-1.

Величина выхода фукоксантина микроводоросли С. closterium зависит, с одной стороны, от накопления биомассы, с другой стороны, от накопления и содержания фукоксантина в самой клетке. В экспоненциальной фазе роста наблюдается увеличение содержания фукоксантина в культуре, в основном за счет увеличения биомассы микроводоросли, в то время как на стационарной фазе роста при постоянной биомассе наблюдается возрастание содержания фукоксантина за счет синтеза его в самих клетках. Поэтому целесообразно выражать содержание фукоксантина в расчете на литр культуры.

Новизна заключается том, что микроводоросль С. closterium выращивают на питательной среде, приготовленной на основе стерилизованной морской воды, с увеличенными концентрациями всех биогенных элементов с использованием фотобиореакторов в виде плоских культиваторов с освещаемой поверхностью 0,0425 м² и толщиной освещаемого слоя 5 см. Показано, что выход фукоксантина на стационарной фазе роста повышается и в конце стационарной фазы роста зависит от концентрации биогенных элементов в среде и толщины освещаемого слоя. Таким образом, использование обедненной стандартной питательной среды F/2 для высокого выхода фукоксантина из культуры С. closterium нецелесообразно.

Общим с прототипом является выращивание диатомовой водоросли С. closterium в накопительном режиме культивирования. Значения количественных параметров заявляемого способа, режимы и условия культивирования экспериментально установлены авторами в оптимальных границах достижения технического результата.

Предлагаемое изобретение поясняется иллюстрациями.

Фиг. 1. Динамика накопления фукоксантина в диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium в расчете на сухую биомассу при накопительном режиме культивирования. А - сухая биомасса; Б - концентрация фукоксантина (Пример 1).

Фиг. 2. Динамика накопления фукоксантина в расчете на литр культуры диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium при накопительном режиме культивирования (Пример 1).

Фиг. 3. Динамика накопления фукоксантина в расчете на литр культуры диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium при накопительном режиме культивирования (Пример 2).

Способ получения биомассы диатомовой водоросли С. closterium с высоким содержанием фукоксантина реализуется следующим образом. Для культивирования используется диатомовая водоросль Cylindrotheca closterium (Ehrenb.) Reimann et Lewin из коллекции культур микроводорослей отдела экологической физиологии водорослей ИМБИ им. А.О. Ковалевского РАН (г. Севастополь), коллекционное хранение которой осуществлялось на питательной среде F/2 при температуре 20-21°C.

Для получения инокулята культура водоросли в течение 5-7 дней выращивается методом накопительной культуры на среде F (Guillard and Ryther, 1963), но в которой концентрации всех биогенных элементов увеличены в пять раз (5F), при освещении 6 клк при непрерывном барботаже воздухом (1 л⋅мин^-1⋅л^-1 культуры)

Для засева культиваторов используется активно делящаяся культура, взятая на линейной стадии роста, когда ее продуктивность максимальна. Суспензию клеток вносят в культиваторы из такого расчета, чтобы начальная плотность культур составляла не менее 0,1-0,2 г сухого вещества на 1 л культуры. Процесс культивирования осуществляется на модифицированной питательной среде (табл. 1) в течение 12 сут.

Пример 1

Для получения инокулята культуру водоросли Cylindrotheca closterium в течение 7 суток выращивали методом накопительной культуры в колбах объемом 1 л при освещении 6 клк на питательной среде F, в которой концентраций всех биогенных элементов увеличили в пять раз (5F). Полученную культуру использовали в качестве инокулята. Активно делящуюся культуру, взятую на линейной стадии роста, когда ее продуктивность максимальна, переносили в фотобиореакторы в виде плоских культиваторов плоскопараллельного типа объемом 3 л с рабочей толщиной слоя 5 см, содержащие модифицированную питательную среду на стерильной морской воде: NaNO3 - 7,50 г⋅л^-1, Na₂SiO3 × 9Н₂0 - 3,00 г⋅л^-1, NaH₂PO4 × 2H₂O - 0,50 г⋅л^-1, Na₂EDTA - 0,872 г⋅л^-1, FeSO₄ × 7H₂O - 0,63 г⋅л^-1, NaMoO₄ × H₂O - 0,063 г⋅л^-1, CuSO₄ × 5H₂O - 0,1 г⋅л^-1, ZnSO₄ × 7 H₂O - 0,22 г⋅л^-1, CoCl₂ × 6H₂O - 0,1 г⋅л^-1, MnCl₂ × 4H₂O - 0,18 г⋅л^-1. Суспензию клеток вносили в культиваторы из такого расчета, чтобы начальная плотность культуры составляла не менее 0,1-0,2 г сухого вещества на 1 л культуры и продолжали выращивать в течение 10-12 суток при освещении 13,5 клк при непрерывном барботаже воздухом со скоростью 1 л⋅мин^-1⋅л^-1 культуры и при температуре 20-21°С до плотности 3,18 г сухой биомассы на 1 л культуры. Выход фукоксантина в биомассе в конце стационарной фазы роста (на девятые сутки культивирования) составил 39,78 мг на 1 л культуры.

Таким образом, выход фукоксантина в предлагаемом способе в 3 раз выше, чем по прототипу.

Пример 2

Активно делящуюся культуру водоросли Cylindrotheca closterium, взятую на линейной стадии роста, когда ее продуктивность максимальна, переносили в культиваторы плоскопараллельного типа объемом 3 л c рабочей толщиной слоя 5 см, содержащие модифицированную питательную среду, приготовленную на основе стерилизованной морской воды: NaNO₃ - 7,50 г⋅л^-1, Na₂SiO3 × 9Н₂O - 3,00 г⋅л^-1, NaH₂PO4 × 2H₂O - 0,50 г⋅л^-1, Na₂EDTA - 0,872 г⋅л^-1, FeSO₄ × 7H₂O - 0,63 г⋅л^-1, NaMoO₄ × H₂O - 0,063 г⋅л^-1, CuSO₄ × 5H₂O - 0,1 г⋅л^-1, ZnSO₄ × 7H₂O - 0,22 г⋅л^-1, CoCl₂ × 6H₂O - 0,1 г⋅л^-1, MnCl₂ × 4H₂O - 0,18 г⋅л^-1. Суспензию клеток вносили в культиваторы из такого расчета, чтобы начальная плотность культур составляла не менее 0,1-0,2 г сухой массы на 1 л культуры. Выращивали при освещении 13,5 клк и при температуре 20-21°С до плотности 3,4 г сухой биомассы на 1 л культуры. Выход фукоксантина в полученной биомассе в конце стационарной фазы роста составил 37 мг на л культуры, что в 3 раз выше, чем в известном способе.

Источники информации, принятые во внимание

1. Das S.K., Hashimoto Т., Kanazawa K. Growth inhibition of human hepatic carcinoma HepG2 cells by fucoxanthin is associated with down regulation of cyclin D // Biochim. Biophys. Acta. - 2008. - 4. - P. 743-749.

2. Guillard R.R., Ryther J.H. Studies on marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Husted and Detonula confervacea (Cleve) Cran // Can J. Microbiol. - 1963. - 8. - P. 229-239.

3. Pasquet V., J.-R., Farhat F., V., Piot J.-M., J.-B., Kaas R., Serive В., Patrice Т., Cadoret J.-P., Picot L. Study on the microalgal pigments extraction process: Performance of microwave assisted extraction // Process Biochemistry. - 2011. - 46. - P. 59-67.

4. Peng J., Yuan J., Wu C., Wang J. Fucoxanthin a Marine Carotenoid Present in Brown Seaweeds and Diatoms: Metabolism and Bioactivities Relevant to Human Health // Mar. Drugs. - 2011. - 9. - P. 1806-1828.

5. Rijstenbil J.W. Effects of UVB radiation and salt stress on growth, pigments and antioxidative defence of the marine diatom Cylindrotheca closterium // Mar. Ecol. Prog. Ser. - 2003. - 254. - P. 37-48.

6. Moreau D., Tomasoni C., Jacquot C., Kaas R., Le Guedes R., Cadoret J.P., Muller-Feuga A., Kontiza I., Vagias C., Roussis V., Roussakis C. Cultivated microalgae and the carotenoid fucoxanthin from Odontella aurita as potent antiproliferative agents in bronchopulmonary and epithelial cell lines // Environ. Toxicol. Pharmcol. - 2006. - 22. - P. 97-103.

7. Nomura Т., Kikuchi M., Kubodera A., Kawakami Y Proton-donative antioxidant activity of fucoxanthin with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) // Biochem. Mol. Biol. Inf. - 1997. - 42. - P. 361-370.