Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПИГМЕНТОВ И НЕСТЕРОИДНЫХ ФИТОЭСТРАГЕНОВ В ОВСЕ И ЛЮЦЕРНЕ

Изобретение относится к области фитопатологии, фармакологии, сельскому хозяйству и нанотехнологиям. Конкретно, к способам повышения содержания фотосинтетических пигментов нестероидных фитоэстрагенов и биологически активных веществ (БАВ) в злаковых и бобовых культурах.

Известен способ предпосевной обработки семян сельскохозяйственных растений» [1], в котором обработку семян сельскохозяйственных растений проводят раствором биологически активного вещества, содержащим ионы серебра. При этом источником ионов серебра является коллоидный раствор наночастиц серебра AgБион-2 с концентрацией его в рабочей жидкости 0,0047% при норме ее расхода 10 л/т семян. Обработку ведут путем опрыскивания семян перед посевом. Способ позволяет ускорить произрастание сельскохозяйственных растений, сократить вегетационный период, в частности, в зоне рискованного земледелия и повысить урожайность. Однако, область применения известного способа ограничена.

Наиболее близким к предлагаемому является способ повышения содержания фотосинтетических пигментов пшеницы мягкой Triticum vulgareVill [2]. Способ осуществляют следующим образом [2]. Семена растения вида (Triticum vulgare Vill) дезинфицируют 0,01%-ным раствором калия перманганата KMnO₄ в течении 5 мин и после трехкратного промывания дистиллированной водой помещают на подложку из фильтровальной бумаги в пластиковые контейнеры по 30 штук. Затем в каждый анализируемый образец наливают по 5 мл приготовленных непосредственно перед проведением эксперимента растворов в дистиллированной воде 2,0 и 0,5 мг/л средства «Мегамикс», 2⋅10^-3 - 1⋅10^-9 мг/л наночастиц железа Fe⁰. Для приготовления растворов точные навески соответствующих реактивов помещают в стеклянные колбы с дистиллированной водой и интенсивно диспергируют ультразвуком с частотой 35 кГц в течение 15 минут. Растворы с меньшей концентрацией получают постепенным разбавлением и исходного раствора. Контрольный вариант пробы выращивают на дистиллированной воде. Приготовленные подобным образом опытные и контрольные пробы оставляют для проращивания при естественном 12-ти часовом освещении и температуре воздуха 23±1°С в течении 14 суток.

Известный способ обработки семян, повышающий содержание фотосинтетических пигментов у пшеницы Triticum vulgareVill, является наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению.

Недостатком известного способа является то, что перед обработкой наночастицами железа Fe⁰, осуществляют предварительную обработку семян растений (дезинфицируют 0,01%-ным раствором калия перманганата KMnO₄). Пермангант калия, как известно, оказывает антимикробное, антисептическое, противовоспалительное, дезинфицирующее, обеззараживающее, антитоксическое действие [3]. Обеззараживающее действие перманганата калия обусловлено способностью окислять различные органические соединения, в процессе чего выделяется атомарный кислород. Далее оксид образует с белками комплексные соединения - альбуминаты (связывающая способность). Также широко известно, применение перманганата калия как стимулятора роста растений (в концентрациях - 0,01%), т.е. раствор калия перманганата оказывает не только антибактериальное действие на семена растений, но и стимулирующее физиологические процессы роста и развития растений.

Также, недостатком известного способа является то, что исследуемые семена подвергаются смачиванию и неоднократному промыванию дистиллированной водой. Промывание и замачивание в воде способствует запуску биохимических процессов в семенах. Вода поглощается главным образом за счет физических свойств семени через определенные участки кожицы (наиболее активно - в месте соединения зародыша с эндоспермом). Имеющиеся в семени осмотически активные вещества стимулируют поступление воды внутрь [4]. На этой стадии активируются все биохимические системы. Например, зародыши пшеницы могут уже через 10 минут после начала набухания включить синтез РНК и белков.

Задачей предлагаемого технического решения является разработка способа повышения содержания фотосинтетических пигментов в злаковых и бобовых культурах и повышение содержания нестероидных фитоэстрагенов и других биологически активных веществ в бобовых культурах.

Технический результат предлагаемого изобретения - повышение устойчивости злаковых и бобовых культур, в частности, овса голозерного Avena (nuda L.) и люцерны Medicago Sativa L. nothosubsp. varia (Martyn) к фитопатогенам за счет повышения содержания фотосинтетических пигментов и повышение содержания нестероидных фитоэстрагенов и других биологически активных веществ в бобовых культурах в частности, в люцерне Medicago Sativa L. nothosubsp. varia (Martyn).

Новый технический результат достигают способом повышения содержания фотосинтетических пигментов и содержания нестероидных фитоэстрагенов и других биологически активных веществ в злаковых и бобовых культурах, включающем предпосевную обработку семенного материала рабочим раствором с диспергированной суспензией наночастиц, причем, суспензия содержит наночастицы диоксида кремния с недостатком кислорода (SiO_x, x>2) средним размером 5-9 нм, при норме расхода раствора 1-5 мл/кг семян с концентрацией суспензии в рабочей жидкости от 0,01% - 0,1%, обработку проводят 5-ти кратно, при этом, семенной материал обрабатывают путем опрыскивания диспергированной суспензией, затем перемешивают в течение 3-5 минут, также, после обработки оставляют на подсушку на 6 часов при температуре 23±1°С.

Способ осуществляют следующим образом.

Семенной материал обрабатывают рабочим раствором с диспергированной суспензией, наночастиц диоксида кремния с недостатком кислорода (SiO_x, x>2) средним размером 5-9 нм, также, обработку проводят 5-ти кратно при норме расхода 1-5 мл/кг семян суспензии раствора с концентрацией от 0,01% - 0,1%, при этом, семенной материал обрабатывают путем опрыскивания диспергированной суспензией, затем перемешивают в течение 3-5 минут, также, после обработки оставляют на подсушку на 6 часов при температуре 23±1°С.

Способ разрабатывали на базе лабораторий СибНИИСХиТ (г. Томска) по классической схеме исследований (исследование проводили на однодольных и двудольных растениях). Предварительные исследования проводили в лабораторных условиях - изучение влияния различных концентраций суспензии наночастиц кремния на культуры, дальнейшие исследования проводили в полевых условиях на стационаре СибНИИСХиТ. При проведении исследований использовали наночастицы диоксида кремния, полученные методом импульсной лазерной абляции излучением ИК лазера, наносекундной длительности импульсов мишени монокристаллического кремния в дистиллированной воде. Средний размер частиц - 7 нм (5 нм -9 нм), массовая концентрация частиц в растворе составляла (28,7 мг/л -31 мг/л). Частицы были с дефицитом кислорода относительно идеальной структуры SiO₂ и, следовательно, высокодефектны по своей структуре (наночастицы были предоставлены Сибирским физико-техническим институтом им. академика В.Д. Кузнецова НИ ТГУ, г. Томск). Подробное описание физико-химических свойств использованных для обработки семян растений наночастиц диоксида кремния приведено в [14].

Важной особенностью применяемых наночастиц, полученных высокоэнергетическим физическим методом - импульсной лазерной абляцией, является их дефектность, что приводит к новым оптическим, антибактериальным и каталитическим свойствам.

Из многих видов наночастиц, получаемых методом импульсной лазерной абляции в жидкости, нетоксичные, биосовместимые (как микроэлемент в составе растений) кремнийсодержащие материалы представляют большой интерес. ''Эко'' синтетические методы в воде без использования химических реагентов позволяют использовать полученные наночастицы в медицине, фитопатологии, фармакологии, в сельском хозяйстве и экологии.

Кремний на 2-2.5 недели ускоряет созревание кукурузы и прорастание семян ячменя и риса, увеличивает корневую массу ячменя [5], усиливает фотосинтез и рост растений риса, ускоряет его созревание, воздействует на азотный, фосфатный и калийный обмен. Он способствует повышению засухоустойчивости растений [6, 7], устойчивости растений к поражению грибковыми заболеваниями, насекомыми-вредителями, полеганию, низким температурам.

Как известно, овес голозерный - Avena (nuda L.) это ценная продовольственная и кормовая культура - питательнее обычного (пленчатого) посевного овса, в нем содержится большее количество жиров и протеинов, а также лизина. Клетчатки до 10,7% - известной своими полезными свойствами, половину из них составляют растворимые в воде ценные пищевые волокна бета-глюканы. Зерно овса голозерного богато микро- и макроэлементами (калий, магний, кальций, кремний, фосфор, натрий, хром, железо, марганец, алюминий, кобальт, медь, фтор, молибден, сера, бор, ванадий, йод, никель, селен, олово, титан, цинк, стронций, цирконий). Голозерный овес также богат полезными и незаменимыми для организма человека витаминами, в его состав входят витамины - А, Е, К, В₁, В₂, В₃, В₆, В₇, В₉. Однако также известно, высокая подверженность голозерного овса, к различным фитопатогенам (например головневые, ржавчинные, грибные болезни), чем у пленчатого овса. Исследования, направленные на решение этой проблемы, является актуальными [8, 9, 10].

Люцерна одна из основных многолетних бобовых кормовых культур. Ее характерными признаками является долголетие, высокая адаптивная способность к различным природным условиям, многоукосность, зимостойкость и засухоустойчивость. Люцерна изменчивая - Medicago Sativa L. nothosubsp. varia (Martyn), сорт «Сарга» включен в Госреестр с 1992 г. Распространен в Западной Европе, культивируется в Европейской части России, в Сибири и на Дальнем Востоке. Сорт характеризуется хорошим отрастанием весной и после укосов, а также высокой кормовой продуктивностью до 6-7 лет. Имеет высокий сбор сухого вещества и в условиях богары (6,5-9,0 т/га), при орошении (10,5-14,2 т/га). Урожайность зеленого вещества может составить до 40-60 т/га. По семенной продуктивности люцерна «Сарга» превышает лучший и средний стандарт от 150 до 270 кг/га. Выход кормовых единиц 45 кг на 100 кг сухого вещества, и 27 - в зеленом. Норма высева на корм 15-20 кг/га, на семена 7-10 кг/га. Листья и плоды «Сарги» содержат такие минеральные элементы, как калий, кальций, фтор. А также различные углеводы, белки, жирные кислоты, эфирные масла, пектины, ферменты, хлорофилл, алкалоиды, каротин и др. Сорт «Сарга» за счет фиксации азота из воздуха оставляет в почве с корневыми и пожнивными остатками до 150-170 кг/га биологического азота. Увеличение площади посева люцерны позволит сохранить бездефицитный баланс гумуса в почвах и их плодородие. Люцерна изменчивая, сорт «Сарга» интродуцируется в условиях подтаежной зоны Томской впервые в проводимом исследовании.

Химический состав люцерны представлен комплексом биологически активных веществ. Доминирующими биологически активными веществами являются: изофлавоноиды, гидроксикоричные кислоты, хлорофилл, белки, аминокислоты, в том числе незаменимые, витамины, макро- и микроэлементы.

Изофлавоноиды (фитоэстрогены) - вещества, способные модулировать специфические ответы тканей мишеней репродуктивных органов а, следовательно, и на рецепцию, продукцию и метаболизм эндогенных гормонов, а также на их действие на клеточном уровне. Эстрогеноподобная активность изофлавоноидов может быть связана и с другими механизмами, например, с их способностью стимулировать образование в печени глобулинов, связывающих половые стероиды, и таким путем модулировать биологическую активность эндогенных половых гормонов. Другим возможным механизмом может быть влияние на активность ферментов ароматазной системы, ингибирование перехода андростендиона в эстрон, а последнего - в 17-бета эстрадиол. В литературе имеются сведения о том, что изофлавоноид генистеин ингибирует активность тирозин специфической протеинкиназы, «работающей на уровне рецепторов», к ряду ростовых факторов: эпидермальному, инсулино-подобному, тромбо- и моноцитарному, играющих важную роль в регуляции процессов пролиферации и трансформации клеток. Гидроксикоричные кислоты оказывают противовоспалительное действие, обеспечивают антимикробное и иммунотропное действие [11, 12].

В предлагаемом изобретении, включающем предпосевную обработку семенного материала растений диспергированной суспензией, суспензия содержит наночастицы диоксида кремния среднего размера частиц - 7 нм (5 нм -9 нм), причем семенной материал обрабатывают путем опрыскивания по 1 мл/кг (1 мл -5 мл) диспергированной суспензией с концентрацией раствора - 0,1%, 0,5%, 0,01%, затем перемешивают в течение 3-5 минут. Количество повторений обработки 5-ти кратное для достижения равномерного увлажнения поверхности семенной оболочки семян, затем семенной материал оставляют на подсушку на 6 часов при температуре 23±1°С.

Контрольные варианты опытов не подвергали обработке. Опытные варианты не подвергались скарификации и инокуляции. Посев проводили через 24 часа. Закладку опытов проводили по методике Б.А. Доспехова [13] (мелкоделяночные опыты) в естественных агроклиматических условиях, распределение опытов систематическое, в 3-х повторениях. Отбор растительных образцов проводили в разные фенофазы растений, овес голозерный фаза - выход в трубку; люцерна изменчивая в фазу бутонизации и созревания.

Анализ содержания хлорофиллов определяли в спиртовой вытяжке на спектрофотометре UV-1601 фирмы SHIMADZU (Япония) при длинах волн 665 нм, 649 нм и 440,5 нм с последующим расчетом по формулам Вернона.

Данные представлены при двух методах статистического обсчета данных:

Полученные данные обрабатывали методом дисперсионного анализа с помощью пакета прикладных программ Snedekor [13]. В таблицах 1-4 представлены данные в виде среднего арифметического из 3-х биологических повторностях.

Данные обсчитаны с применением пакета программ Statistika 6,0. Расчет по непараметрическим критериям Mann-Whitney. В таблицах данные представлены в виде медиан.

Анализ результатов доказывает, что обработка семенного материала овса и люцерны суспензией наночастиц диоксида кремния, средним размером 7 нм раствором в концентрациях - 0,1%, 0,05%, 0,01%, способствует повышению содержания фотосинтетических пигментов в листьях овса от 2,3% до 11,5% и в траве люцерны от 51% до 92,5%.

Исследование влияния различных концентраций наночастиц кремния на содержание хлорофилла в листьях овса и траве люцерны, в сравнении с прототипом, отражено в таблице 5.

На основе полученных данных можно сделать вывод, что, по сравнению с прототипом, обработка семенного материала овса голозерного и люцерны изменчивой суспензией наночастиц диоксида кремния средним размером 7 нм (5 нм -9 нм), в концентрациях p.p. 0,1%, 0,05%, 0,01%, способствует повышению содержания фотосинтетических пигментов в листьях овса от 87% до 146,8%, в траве люцерны от 109,2% до 89,4%, что повышает устойчивость к развитию хлороза и к другим фитопатогенам.

Содержание изофлавоноидов и гидроксикоричных кислот в % в пересчете на абсолютно сухое сырье оценивали по известным методикам [10, 11]. Данные (Таблица 6) представлены в виде среднего арифметического из 3-х повторностей.

Как следует из представленных в таблице 6 данных обработка наночастицами диоксида кремния в концентрации 0,05% приводит к увеличению содержания в надземной части люцерны только к концу вегетации (08.10.2015) изофлавоноидов и гидроксикоричных кислот по сравнению с контролем. Данная тенденция отчетливо прослеживается, как при использовании в качестве экстрагента для их извлечения как 40%, так и 70% этилового спирта. В первом случае содержание изофлавоноидов и гидроксикоричных кислот увеличивается на 14-29% соответственно, а при использовании 70% этанола - на 14-40% соответственно.

Предлагаемый способ обработки эффективен и экономичен и перспективен для применения с целью повышения устойчивости злаковых и бобовых культур, в частности, овса голозерного Avena (nuda L.) и люцерны Medicago Sativa L. nothosubsp. varia (Martyn) к фитопатогенам за счет повышения содержания фотосинтетических пигментов и повышение содержания нестероидных фитоэстрагенов и других биологически активных веществ в бобовых культурах в частности, в люцерне Medicago Sativa L. nothosubsp. varia (Martyn).

Источники информации

1. Патент RU №2463757, опубл. 20.10.2015.

2. Патент RU №2539861 опубл. 27.01.2015.

3. Интернет ресурс// http://articlemen.com/chem-polezna-margancovka.html

4. Зотикова А.П., Бендер О.Г., Рудник Т.И. Экофизиологические реакции листового аппарата кедра сибирского на изменение климата // Оптика атмосферы и океана. 2006. Т. 19, №11. С. 969-972.

5. Строганов Б.П. Физиологические основы солеустойчивости растений. М., 1962. 225 с.

6. Bocharnikova Е.A. The increase of plant growth resistance of air pollution influence // Proc. Worldwide Symp. Poll, in large cities. Venice, Padova. Italy, 1995. P. 215.

7. Алешин H.E. Кремниевое питание риса // С.-х. за рубежом. Растениеводство. 1982. №6. С. 9-14.

8. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев / Биохимические методы в физиологии растений. - М.: Наука, 1971. - С. 154- -170.

9. Павлов Г.В. Биологическая активность ультрадисперсных порошков / Г.В. Павлов, Г.Э. Фолманис. - М.: Исследовательский центр проблем качества подготовки специалистов, 1999. - 77 с. 4.

10. Полуэктова Т.В. Стандартизация климактерического сбора /Т.В. Полуэктова, Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // Фармация, 2012. - №6. - С. 23-26.

11. Крупникова Т.А. Количественное определение оксикоричных кислот в листьях кукурузы / Т.А. Крупникова, Л.И. Драник, В.Н. Давыдова // Растительные ресурсы, 1971. - вып. 3. - С. 449-452.

12. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Агропромиздат, 1985. 351 с.

13. Сорокин О.Д. Прикладная статистика на компьютере/ О.Д. Сорокин. - Новосибирск, 2004. - 162 с.

14. Svetlichnyi V.A., Izaak T.I., Lapin I.N., Martynova D.O., Stonkus O.A., Stadnichenko A.I., Boronin A.I. Physicochemical investigation of nanopowders prepared by laser ablation of crystalline silicon in water // Advanced Powder Technology. - 2015. - V. 26. No. 2. P478-486.

Приложение

Таблица 1 - Содержание фотосинтетических пигментов в подфлаговом листе овса (фаза выхода в трубку), мг/г сухой массы

Таблица 2 - Содержание фотосинтетических пигментов в листьях люцерны (фаза бутонизации), мг/г сухой массы

Примечание. Различия с контролем достоверны при Р≤0,05

Таблица 3 - Содержание фотосинтетических пигментов в подфлаговом листе овса (фаза выхода в трубку), мг/г сухой массы

Примечание. * - статистически значимое отличие от контрольного варианта по Mann-Whitney.

Таблица 4 - Содержание фотосинтетических пигментов в листьях люцерны (фаза бутонизации), мг/г сухой массы

Таблица 5 - Сравнительный анализ результатов содержания фотосинтетических пигментов (хлорофилл) в представленных культурах

Примечание: Для сравнительного анализа взят результат ∑а+b хлорофилла, т.к. в прототипе не указаны данные по хлорофиллу а и b

Таблица 6 - Содержание нестероидных фитоэстрагенов, в частности, изофлавоноидов и гидроксикоричных кислот в люцерне, %

2. Данные обсчитаны с применением пакета программ Statistika 6,0. Расчет по непараметрическим критериям Mann-Whitney. В таблицах данные представлены в виде медиан.