Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ BRADYRHIZOBIUM DIAZOEFFICIENS CCM GS-4 (ВКПМ В-12660) - РИЗОБИАЛЬНЫЙ КОМПОНЕНТ МИКРОБНОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ПРЕДПОСЕВНОЙ ОБРАБОТКИ СОИ

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium diazoefficiens ССМ GS-4 для получения микробиологического удобрения, повышающего продуктивность сои.

В настоящее время для повышения урожайности бобовых культур используют бактериальные удобрения, изготовляемые на основе азотфиксирующих клубеньковых бактерий. Существует ряд ранее запатентованных штаммов клубеньковых бактерий, которые применялись в качестве монокомпонентных биопрепаратов под сою, согласно авторским свидетельствам и патентам на изобретение в период с 1979 по 2013 гг., а именно: Rhizobium japonicum 626а, Rhizobium japonicum 646, Rhizobium japonicum 614a, Rhizobium japonicum 634б, Rhizobium japonicum 24108 (71 т), Bradyrhizobium japonicum M-8, Bradyrhizobium japonicum КН 10, Bradyrhizobium japonicum T66, Bradyrhizobium japonicum 36, Bradyrhizobium japonicum 46, Bradyrhizobium japonicum 206, Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D (MM-117), Bradyrhizobium japonicum БМ-85к, Bradyrhizobium japonicum 859, Bradyrhizobium japonicum См-42к.

Однако остается нерешенным вопрос стабильности и эффективности таких биопрепаратов на практике. Главным образом, это обусловлено созданием так называемых "универсальных биопрепаратов", при разработке которых не учитывается зависимость растительно-микробного симбиоза от ряда параметров: сорт-штаммовой специфичности, влияния почвенной микробиоты, агроклиматических условий возделывания бобовой культуры и агрофона, на котором проводилась селекция используемых сортов растений. И самое главное - зачастую не проводится оценка влияния компонентов таких биопрепаратов на почвенный биоценоз, оценка остаточного эффекта интродуцированных штаммов-инокулятов на местные популяции клубеньковых бактерий, в том числе сохранность их после первого года вегетации растений-хозяев. Поэтому для создания эффективного симбиоза так важен принцип "комплементарности пар", базирующийся на знаниях биоразнообразия партнеров.

Краткое описание чертежа

Биоразнообразие микросимбионтов сои главным образом представлено 6 генетически удаленными группами штаммов: 3 группы вида В. japonicum: USDA 123 - к этой группе относятся конкурентоспособные, но малоэффективные штаммы клубеньковых бактерий; USDA 6Т - типовая группа штаммов данного вида, эффективных в симбиозе с соей, в нее попадают производственные штаммы 626а, 46 и КН-10; USDA 4 - группа эффективных штаммов, к которой относятся производственные штаммы 36 и М-8; 1 группа вида В. diazoefficiens USDA 110, к которой относится производственный штамм 634б и предложенный в настоящей заявке штамм ССМ GS-4; и штаммы видов В. liaoningense, В. elkanii. На чертеже представлено филогенетическое дерево, построенное на основе данных мультилокусного секвенирования (MLSA) нуклеотидных последовательностей клубеньковых бактерий рода Bradyrhizobium sp. с использованием алгоритма Neighbor-Joining. Масштаб соответствует 1 замене на 100 пар оснований (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (в %), определенная с помощью «bootstrap» - анализа 1000 альтернативных деревьев.

Реализация принципа «комплементарности пар» основана на коэволюции штаммов определенных групп с сортами растений-хозяев, обусловленной агрофоном, на котором проводилась селекция используемых сортов растений и агроклиматическими условиями возделывания. Предложенный штамм В. diazoefficiens ССМ GS-4 представляет собой медленнорастущие клубеньковые бактерии, обладающие большей эффективностью на современных сортах сои отечественной селекции по сравнению с применяемыми ранее штаммами, в том числе 634б.

Штамм бактерий В. diazoefficiens CCM GS-4 был получен С.В. Дидович и Н.З. Толкачевым в 2003 г. методом аналитической селекции. Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками: клетки 7-суточной культуры штамма имеют форму палочек, размером 0.4-1.2 мкм в ширину и 1.5-2.0 мкм в длину, подвижные благодаря полярному жгутику (монотрихи). Штамм грамотрицательный, спор не образует, облигатный аэроб. Рост бактерий при посеве штрихом на агаризованной гороховой среде с глюкозой или маннитом слабый, штрих беловатый, слизистый. Относятся к медленнорастущим клубеньковым бактериям, колонии появляются на поверхности агара на 7-8 сутки, имеют округлую форму, до 1 мм в диаметре, выпуклые, блестящие, слизистые. Штамм активно усваивают глюкозу, фруктозу, арабинозу, рафинозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, маннит, сорбит, дульцит. Отсутствие фермента инвертазы не дает возможность усваивать сахарозу. Как источник азота использует аммонийный, нитратный, амидный азот. На средах с органическим азотом (МПА) штамм не растет. Молоко с лакмусом подщелачивает, не пептонизует. Желатин не разрежает, не имеет протеолитического фермента желатиназы, не гидролизует крахмал, казеин, агар, не имеет амилазной и оксидазной активности, характеризуется денитрифицирующей способностью, уреазной и каталазной активностью. Штамм имеет активную нитратредуктазу и восстанавливает нитраты. Прототроф, чувствителен к антибиотикам. Флуоресцирующих и феназиновых пигментов не образует. Штамм синтезирует аммоний из азота воздуха в симбиозе с растением-хозяином, синтезирует ростстимулирующие вещества типа фитогормонов. Температурный интервал роста штамма на плотных и в жидких средах составляет 18-37°C, а температурный оптимум - 25-28°C, штаммы отнесены к мезофилам. Рост бактерий наблюдается в диапазоне pH 4.5-8.5, оптимальной для развития клеток штамма является близкая к нейтральной реакция среды pH 6.5-7.5, штамм отнесен к нейтрофилам. Признаки штамма стойкие.

Штамм В. diazoefficiens ССМ GS-4 образует активные клубеньки с современными сортами сои (Glycine max (L.) Merr.) отечественной селекции. На фасоли, нуте, люпине, горохе, бобах, эспарцете, люцерне, козлятнике, клевере, лядвенце клубеньков не образует.

Для хранения и культивирования штамма В. diazoefficiens ССМ GS-4 в лабораторных условиях используют маннитно-дрожжевой агар (МДА) с добавлением глюкозы при pH 6,8±0,2 следующего состава, г/л:

маннит - 10 г

глюкоза - 10 г

дрожжевой экстракт - 1 г

К₂НРО₄×4Н₂0 - 0.5 г

MgSO₄×7H₂O - 0,2 г

NaCl - 1 г, CaCO₃ - 3 г

агар - 20 г

вода дистиллированная - 1 л

Хранение штамма при 4-6°C. Пересев 1 раз в полгода.

Для промышленного культивирования штамма В. diazoefficiens ССМ GS-4 используют среду при pH 6,8±0,2 следующего состава, на л: кукурузный экстракт - 7 г, дрожжи пекарские - 0.5 г, глюкоза - 12 г, (NH₄)₂SO₄ - 1 г, К₃РO₄×3Н₂O - 0.35 г, MgSO₄ - 0,2 г, CaCO₃ - 1 г. Посевная доза - 5% от объема питательной среды. Культивирование осуществляют при 28°C в течение 3 суток.

Эффективность штамма бактерий В. diazoefficiens CCMGS-4 определяли:

- в вегетационных опытах по симбиотическим показателям (кол-во, масса и азотфиксирующая активность клубеньков - ацетиленовый метод определения азотфиксирующей активности /Hardy et al., 1968/) на сортах украинской селекции, используемых в качестве тестовых для первичного анализа;

- в полевых опытах по продуктивности растения-хозяина (урожайность семян; кол-во сырого протеина в семенах - метод Кьельдаля /ГОСТ 10846-91 «Зерно и продукты его переработки»/)) на производственных сортах российской селекции.

Схема проведенных опытов предполагала сравнение влияния предложенного штамма В. diazoefficiens ССМ GS-4 с применяемыми техническими штаммами, показавшими лучшие результаты по исследуемым показателям при предыдущих селекциях, на различных сортах сои (табл. 1, 2). Эффективность бобово-ризобиального симбиоза связана со специфичностью растительно-микробных взаимодействий. Данный штамм В. diazoefficiens проявляет большую специфичность по отношению к сое, что позволяет использовать его в качестве активного компонента для микробиологического препарата.

Примечание: Н.А. - нитрогеназная активность

В мелкоделяночном опыте были проведены испытания на производственных сортах российской селекции Зуша и Красивая Меча, в качестве инокулятов были использованы по 2 штамма из каждой генетически удаленной группы симбионтов сои (табл. 4). Отрицательным контролем служил вариант опыта без микробной обработки. Как видно из таблицы 4, в почве отсутствовали местные популяции клубеньковых бактерий сои, поэтому полученные данные являются следствием различной эффективности бобово-ризобиального симбиоза с интродуцированными штаммами.

Для последующей стадии полевых испытаний на производственных сортах российской селекции Зуша и Красивая Меча был отобран штамм В. diazoefficiens ССМ GS-4, образующий наибольшее количество активных (розовых) клубеньков и производственные штаммы сравнения - В. diazoefficiens 634б и В. japonicum 36. Испытания проводились в Орловской области на базе ФГБНУ «ВНИИ зернобобовых и крупяных культур» (табл. 5 и 6).

В результате проведенных полевых испытаний было показано, что предложенный в настоящей заявке штамм В. diazoefficiens ССМ GS-4 обеспечивает максимальную прибавку урожайности сортов Зуша и Красивая Меча - 3,5 ц/га (16,5%) и 3,9 ц/га (18,4%) в сравнении с контролем, соответственно. При этом наблюдается повышение содержания белка в семенах сои сорта Зуша - на 1,2% и сорта Красивая Меча - на 1,4%. Таким образом, при обработке семян сои современных сортов отечественной селекции эффективность биоудобрений, полученных на основе указанного штамма В. diazoefficiens ССМ GS-4, превышала на 7,5-8% по показателю урожайности семян, а по содержанию сырого протеина в семенах - на 0,6-1,2% аналогичные показатели производственного штамма В. japonicum 634б.

Все изложенное указывает на возможность использования штамма клубеньковых бактерий В. diazoefficiens ССМ GS-4 для изготовления препаратов - удобрений для предпосевной обработки семян сои в виде концентрата бактериальной суспензии с титром не менее 10⁹ КОЕ/мл.