Результат интеллектуальной деятельности: Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии, в частности к веществам, которые могут использоваться в качестве реагента - биологического модуля - в биолюминометрах и устройствах типа «биосенсор» для определения количества микробного загрязнения объектов окружающей среды, продуктов питания и др.

Принцип работы биосенсоров для анализов микробных загрязнений основан на количественном определении молекул аденозин-5'-трифосфата (АТР), концентрация которых пропорциональна количеству КОЕ (колониеобразующих единиц) в образце.

В настоящее время для анализов микробного загрязнения окружающей среды применяют реагенты ферментов, иммобилизированные на высокомолекулярных носителях физическими и химическими способами.

Известен аналогичный реагент, используемый в качестве биомодуля, для анализа химической токсичности различных сред, включающий дозировано иммобилизированные в гель люциферазу, НАДН : ФМН - оксидоредуктазу, миристиновый альдегид, никотинамидадениндинуклеотид (НАДН), дитиотриетол (ДТТ) [Патент на изобретение RU 2413772 «Биолюминесцентный биомодуль для анализа токсичности различных сред и способ его приготовления», опубл. 10.03.2011]. Известный реагент предназначен для оценки химического загрязнения образцов различными веществами и не пригоден для анализа микробного загрязнения.

Прототипом изобретения является реагент для определения аденозин-5'-трифосфата [Патент RU 2164241 Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, МПК C12Q 1/66, C12N 11/12, опубл. 20.03.2001], предназначенный для количественного определения АТР и включающий люциферазу светляков, иммобилизированную на полисахаридном носителе, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с ДТТ в качестве стабилизатора, а также дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина (БСА) и трегалозы и воду.

Недостатком прототипа является снижение эргономичности количественного анализа, обусловленное необходимостью разведения реагента специализированным буферным раствором, а также недостаточно высокая стабильность реагента при комнатной температуре, что создает неудобства при работе: необходимо специальное охлаждение и периодическая проверка калибровочного графика - зависимости интенсивности свечения от концентрации АТР. Кроме того, при получении реагента используют дорогостоящий носитель, а в качестве одного из стабилизаторов используют высокие концентрации трегалозы.

Технической проблемой изобретения является повышение эргономичности количественного анализа посредством получения комплекса дозированных реагентов, предназначенных для проведения одного количественного анализа, повышения стабильности реагентов для определения АТР при хранении и использовании, упрощения процедуры приготовления реагента, а также снижение его стоимости.

Сущность изобретения заключается в том, что в комплексе реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата, состоящего из двух реагентов - люциферина в качестве субстрата и ферментного препарата, содержащего люциферазу светляков, буферный раствор, стабилизирующие добавки дитиотриетол и бычий сывороточный альбумин, согласно изобретению каждый из реагентов - ферментный препарат и люциферин, отдельно иммобилизированы на высокомолекулярном носителе. Ферментный препарат иммобилизирован в желатиновый гель при количественном соотношении люциферазы светляков и желатина от 1:50 до 1:90. Люциферин иммобилизирован в желатиновый гель при количественном соотношении от 1:15 до 1:50 или в крахмальный гель при количественном соотношении от 1:40 до 1:150. Доза каждого из реагентов для одного количественного анализа отдельно иммобилизирована на автономном носителе с возможностью образования его твердой формы - стеклообразного состояния высокомолекулярного соединения - желатина или крахмала.

Техническим результатом изобретения является получение комплекса автономно дозированных реагентов, предназначенных для проведения одного количественного анализа, повышение стабильности реагентов для определения АТР при хранении и использовании, упрощение процедуры приготовления реагента, что способствует повышению эргономичности процесса.

Техническим результатом изобретения также является снижение стоимости комплекса реагентов за счет использования в качестве носителя дешевых высокомолекулярных соединений - желатина и крахмала.

Количественный анализ АТР проводят следующим образом. Готовят комплекс реагентов. Дозу каждого из реагентов иммобилизируют известным способом в высокомолекулярный носитель - гель при помощи известного оборудования, например автоматического дозатора. Ферментный препарат, состоящий из люциферазы светляков, буферного раствора и стабилизирующих добавок дитиотриетола и бычьего сывороточного альбумина, дозируют и иммобилизируют в желатиновый гель при количественном соотношении люциферазы светляков и желатина в одном реагенте от 1:50 до 1:90.

Люциферин дозируют и иммобилизируют в желатиновый гель при количественном соотношении от 1:15 до 1:50 или в крахмальный гель при количественном соотношении от 1:40 до 1:150.

Доза каждого из реагентов представляет собой количество, достаточное и необходимое для выполнения одного количественного анализа исследуемого вещества в образце с минимальным содержанием АТР - не менее 1×10^-13 М.

Дозирование реагентов, например по 25 мкл, проводят на гидрофобную подложку. Высушивание до образования твердой формы каждой дозы реагента проводят при нормальных условиях без использования вакуумного испарителя. Высушенные реагенты представляют собой тонкие прозрачные дискообразные пленки - «диски». Диски отделяют от подложки и используют для анализа.

Выполняют количественный анализ исследуемого вещества следующим образом. В кювету биолюминометра помещают один иммобилизированный реагент (диск), содержащий 4,2 мкг люциферазы светляков (активность 5,5⋅10¹² усл.ед./мг), 0,5 мМ ДТТ, 0,3 мг/мл БСА, а также один иммобилизированный реагент (диск), содержащий 2,5 мМ люциферина, 1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор рН 7,8, содержащий 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния. Кювету помещают в биолюминометр и регистрируют I_фон. Через 1 час добавляют 20 мкл раствора АТР и регистрируют максимальную интенсивность свечения.

Изобретение поясняется иллюстрациями. На фиг. 1 представлена зависимость интенсивности свечения иммобилизированной люциферазы от концентрации АТР. Фиг. 2 иллюстрирует зависимость относительной интенсивности свечения биолюминесцентной системы светляков от концентрации люциферина, иммобилизированного в крахмальный или желатиновый гель. На фиг. 3 представлена зависимость интенсивности свечения биолюминесцентной системы светляков от концентрации АТР при различных концентрациях люциферина, иммобилизированного в желатиновый гель.

Изобретение поясняется примерами, которые не несут ограничительный характер.

Пример 1.

Реагент на основе люциферазы готовят следующим способом: 0,245 г желатина помещают в 11 мл трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния, оставляют на 30 минут, затем полученную смесь нагревают до 80°С при постоянном перемешивании и охлаждают до 25°С. К 408 мкл полученного геля вносят 6,2 мкл раствора люциферазы светляков, содержащего 0,17 мг фермента (активность фермента 5,5⋅10¹² усл.ед./мг), 100 мкл 5 мМ ДТТ, 100 мкл 3 мг/мл БСА и 386 мкл буферного раствора. Перемешивают и дозируют полученную смесь по 25 мкл на гидрофобную подложку, высушивают при температуре 8°С в течение 24 часов, получают «диски».

Концентрация желатина в одном реагенте составляет 1%, люциферазы светляков - 4,2 мкг, ДТТ - 0,5 мМ, БСА - 0,3 мг/мл.

Определяют чувствительность реагента к АТР. Для измерения параметров свечения в пробе в кювету биолюминометра Lumat LB 9507 (Berthold Technologies, Германия) последовательно вносят реагент, 310 мкл трис-ацетатного буфера рН 7,8 и 20 мкл 2,2 мМ раствора люциферина. Выдерживают кювету при комнатной температуре (25°С) в течение 1 часа, затем кювету помещают в биолюминометр и измеряют интенсивность фонового свечения (I_фон). Затем биолюминесцентную реакцию инициируют добавлением 20 мкл раствора АТР. Смесь быстро перемешивают, помещают в кюветное отделение биолюминометра и регистрируют максимальную интенсивность свечения (I). Интенсивность свечения пропорциональна концентрации АТР в реакционной смеси (фиг. 1). Максимальная чувствительность реагента составляет 0,3 пМ АТР. Диапазон линейной зависимости составляет от 0,3 пМ до 3 нМ.

Пример 2.

а) Реагент на основе люциферина светляков с использованием крахмального геля готовят следующим образом: к 0,6 г крахмала добавляют 11 мл калий-фосфатного буфера рН 7,8, полученную суспензию кипятят в течение 3-х минут, затем охлаждают до 25°С. К 500 мкл полученного геля добавляют 500 мкл раствора люциферина разных концентраций, тщательно перемешивают и дозируют по 25 мкл на лавсановую пленку. Реагенты высушивают при 8°С в течение суток, получают «диски».

б) Реагент на основе люциферина светляков с использованием желатинового геля готовят следующим образом: к 0,2 г желатина добавляют 11 мл трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния, оставляют на 30 минут, затем полученную смесь нагревают до 80°С при постоянном перемешивании. Полученную смесь охлаждают до 25°С, затем к 500 мкл геля добавляют 500 мкл раствора люциферина, тщательно перемешивают и дозируют по 25 мкл на лавсановую пленку. Реагенты высушивают при 8°С в течение суток, получают «диски».

Активность реагентов проверяют путем добавления в кювету 4 мкл раствора люциферазы светляков, содержащего 4,2 мкг фермента (активность фермента 5,5⋅10¹² усл.ед./мг), 1 реагент, содержащий люциферин, иммобилизированный в крахмальный или желатиновый гель, и 326 мкл 1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния. Кювету помещают в биолюминометр и регистрируют I_фон. Через 1 час добавляют 20 мкл 5⋅10^-8 М раствора АТР и регистрируют максимальную интенсивность свечения.

На фиг.2 представлена зависимость относительной интенсивности свечения от концентрации люциферина, иммобилизированного в крахмальный или желатиновый гели. Интенсивность свечения возрастает с увеличением концентрации люциферина в иммобилизированном реагенте. При этом различий в активности биолюминесцентной системы в зависимости от природы геля не наблюдается. Так, при иммобилизации 2,5 мМ люциферина как в крахмальный, так и желатиновый гели интенсивность биолюминесцентной системы остается на уровне контроля.

Пример 3.

Реагент на основе люциферина светляков с использованием желатинового геля готовят способом, аналогичным примеру 2: к 0,2 г желатина добавляют 11 мл трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния, оставляют на 30 минут, затем полученную смесь нагревают до 80°С при постоянном перемешивании. Полученную смесь охлаждают до 25°С, затем к 500 мкл геля добавляют 500 мкл раствора люциферина различных концентраций, тщательно перемешивают и дозируют по 25 мкл на лавсановую пленку. Реагенты высушивают при 8°С в течение суток. Полученные реагенты («диски») содержат люциферин концентрации 0,625 мМ, 1,25 мМ, 2,5 мМ. Количественный анализ АТР проводят с использованием иммобилизированного в желатиновый гель люциферина. В кювету биолюминомерта помещают 1 реагент, содержащий люциферин, 4 мкл раствора люциферазы светляков, содержащего 4,2 мкг фермента (активность фермента 5,5⋅10¹² усл.ед./мг) и 326 мкл 1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния. Кювету помещают в биолюминометр и регистрируют I_фон. Через 1 час добавляют 20 мкл 5⋅10^-8 М раствора АТР и регистрируют максимальную интенсивность свечения.

Фиг. 3 иллюстрирует зависимость интенсивности свечения биолюминесцентной системы светляков от концентрации АТР при различных концентрациях люциферина, иммобилизированного в желатиновый гель. Увеличение содержания люциферина в иммобилизированном реагенте приводит к увеличению интенсивности свечения, т.е. к увеличению чувствительности реагента к АТР. Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы составляет 0,3 пМ АТР и достигается при концентрации люциферина 2,5 мМ.